芳香族氨基酸发酵的生物合成途径及代谢调节机制以及柠檬酸发酵的生产工艺

芳香族氨基酸发酵的生物合成途径及代谢调节机制，以及柠檬酸发酵的生产工艺目录一、芳香族氨基酸二、芳香族氨基酸的生物合成途径三、芳香族氨基酸的代谢调控机制

四、色氨酸发酵机制五、柠檬酸发酵的生产工艺六、柠檬酸发酵工艺

一、芳香族氨基酸芳香族氨基酸---------分子中都含有苯环色氨酸Trp苯丙氨酸Phe酪氨酸Tyr二、芳香族氨基酸的生物合成途径

合成途径特点：

从4-磷酸赤藓糖与磷酸烯醇丙酮酸合成3-脱氧-D-阿拉伯糖型庚酮糖-7-磷酸〔DAHP〕到分支酸，是Phe、Tyr和Trp的共同途径；

从分支酸到预苯酸〔PPA〕，是Phe和Tyr的共同途径；

在分枝酸处，倾向于优先合成氨茴酸；在预苯酸处，倾向于优先合成对羟苯丙酮酸。即优先合成顺序是：Trp-Tyr-Phe。三、芳香族氨基酸的代谢调控机制

大肠杆菌中有三种DAHP合成酶谷氨酸棒杆菌中，在芳香族氨基酸生物合成途径中受调节控制的关键酶：DAHP合成酶〔DS〕、分枝酸变位酶〔CM〕、预苯酸脱氢酶〔PD〕、预苯酸脱水酶〔PT〕和氨茴酸合成酶〔AS〕黄色短杆菌中有一种DAHP合成酶，代谢调节较易控制1、大肠杆菌中芳香族氨基酸生物合成途径与代谢控制

①DAHP合成酶②分支酸变位酶③PPA脱氢酶④PPA脱水酶⑤氨茴酸合成酶2、在黄色短杆菌中芳香族氨基酸生物合成的调节机制

DS－DAHP合成酶CM－分支酸变位酶PD－预苯酸脱氢酶PT－预苯酸脱水酶AS－氨茴酸合成酶四、色氨酸发酵机制

色氨酸生产菌的遗传标记位置色氨酸代谢调控机制〔大量生成和积累色氨酸〕切断支路代谢，选育苯丙氨酸和酪氨酸双重缺陷型〔phe-+tyr-〕的突变株；然后遗传性的解除色氨酸自身的反响抑制和阻遏及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸对DAHP合成酶的反响调节；选育色氨酸多重结构类似物抗性突变株；在发酵过程中限量添加苯丙氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸和酪氨酸发酵机制苯丙氨酸代谢调控机制

首先切断芳香族氨基酸生物合成向酪氨酸和色氨酸的代谢支路，选育色氨酸和酪氨酸双重缺陷型〔tyr-+trp-〕突变株；

然后遗传性的解除苯丙氨酸自身对预苯酸脱水酶和分支酸变位酶的反响抑制和阻遏，及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸对DAHP合成酶的反响调节；

选育苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸多重结构类似物抗性突变株；

发酵中限量添加酪氨酸和色氨酸，使苯丙氨酸大量积累。

柠檬酸发酵机制柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。1874年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体；1913年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。柠檬酸及其盐类、酯类和衍生物是食品工业、药物、美容化装品等生产的重要原料；在工业生产中有着广泛的用途。我国柠檬酸发酵技术处于世界领先水平。如安徽丰原生化公司，柠檬酸生产能力达18万吨，居世界第一位，占世界柠檬酸生产额的17％。五、柠檬酸发酵机理柠檬酸发酵机制1.黑曲霉中80%的糖代谢走EMP途径；2.菌体中存在TCA的酶系，故存在TCA；3.由于不存在苹果酸脱氢酶,草酰乙酸的来源不是由TCA供给；对黑曲霉进行柠檬酸发酵已有的研究说明：4.草酰乙酸主要来自于丙酮酸固定CO2；柠檬酸发酵机制葡萄糖乙酰-CoA草酰乙酸柠檬酸丙酮酸EMP途径脱羧羧化一、合成途径柠檬酸发酵机制葡萄糖6-P-葡萄糖1，6-二磷酸果糖丙酮酸乙酰CoA淀粉磷酸丙糖磷酸烯醇丙糖草酰乙酸柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸Α-酮戊二酸琥珀酸富马酸苹果酸CO2Fe2+CO2CO2柠檬酸发酵机制二、柠檬酸生物合成的代谢调节〔一〕糖酵解及丙酮酸代谢的调节1.铵离子能够解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用，对该酶表现出激活作用；铵离子的浓度与柠檬酸生成速度、积累有密切关系，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量；柠檬酸发酵机制葡萄糖6-P-葡萄糖1，6-二磷酸果糖丙酮酸乙酰CoA磷酸丙糖磷酸烯醇丙糖草酰乙酸柠檬酸CO2CO2CO2ATPAMPPiNH4+K+柠檬酸发酵机制2.培养基中锰缺乏时，黑曲霉的合成代谢受损伤，菌体结构不完整，但铵和氨基酸水平升高〔锰缺乏时，蛋白质、核酸合成受阻，导致铵离子升高〕。3.在某些真菌中，丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，但黑曲霉未被证实；柠檬酸发酵机制〔二〕TCA环的调节1.柠檬酸合成酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点。柠檬酸发酵菌的柠檬酸合成酶对乙酰COA的亲和力随草酰乙酸浓度的提高而增大；柠檬酸发酵机制2.顺乌头酸水合酶：理论上此酶失活→TCA环阻断→积累柠檬酸顺乌头酸水合酶需要Fe2+，故在发酵液中添加黄血盐络合Fe2+，顺乌头酸水合酶活性降低；柠檬酸发酵机制顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活。黑曲霉乌头酸水合酶催化的反响存在着柠檬酸：异柠檬酸：顺式乌头酸=90：7：3的平衡关系；黑曲霉对NAD+专一性的异柠檬酸脱氢酶活力很低，却有三种依赖于辅酶NADP+的异柠檬酸脱氢酶，其中的两种与TCA循环有关，它们受到生理浓度柠檬酸的抑制。柠檬酸发酵机制3.α-酮戊二酸脱氢酶：黑曲霉α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低〔TCA环被阻断〕。柠檬酸发酵机制丙酮酸乙酰CoA磷酸烯醇丙糖草酰乙酸柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸Α-酮戊二酸琥珀酸富马酸苹果酸CO2Fe2+CO2CO2Α-酮戊二酸脱氢酶抑制柠檬酸发酵机制3.氧对柠檬酸发酵的影响很大。标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺氧导致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少。柠檬酸发酵机制归纳：②由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反响的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑；有一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链；由此，解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通。柠檬酸发酵机制③由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。六、柠檬酸发酵工艺

1)

试管斜面菌种培养

察氏琼脂培养基：NaNO3

3g，

蔗糖20g，

K2HPO4

1g，

KCl

0.5g，

MgSO4.7

H2O

0.5g，

FeSO4

0.01g，

琼脂20g，

用水定溶至1000ml，

pH自然。

察氏-多氏琼脂培养基：蔗糖30g，NaNO3

2g，

MgSO4.7H2O

0.5g，

KH2PO4

1g，

KCl

0.5g，

FeSO4.7H2O

0.01g，

溴甲分绿0.4g，琼脂20g，

蒸馏水1000ml，

pH自然。1)

试管斜面菌种培养

蔗糖合成琼脂培养基：蔗糖140g，

NH4NO3

2g，

KH2PO4

2g，

MgSO4.7H2O

0.25g，

FeCl3.6H2O

0.02g，

MnSO4.4H2O

0.02g，

麦芽汁20ml，

琼脂20g，

用水定溶至1000ml。

米曲汁琼脂培养基：一份米曲加四倍质量的水，于55℃保温糖化3~4小时后煮沸，滤液用水调整浓度至10‘Bx，并用碱液将pH调制到6.0，接着添加琼脂2%。确认所制成的斜面无杂菌污染后，接入黑曲霉孢子悬液0.1ml，于32℃培养4~5d。2)

种子扩大培养

①

二级扩大培养a

培养基

有琼脂固体培养和液体外表培养两种方法，前者的培养基组成与斜面培养基相同，后者的组成如下：麦芽汁7˚BX，氯化铵2%，尿素0.1%，

2)

种子扩大培养

①

二级扩大培养b

培养

固体培养时，500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基，250ml茄子瓶装50ml琼脂培养基。灭菌后摆成斜面，凝固后的斜面至37℃下培养24h。确认无杂菌污染即可使用。

液体培养时，将液体培养基装入三角瓶中，使液层深度达45cm，于0.1MPa下湿热灭菌15min。按无菌操作接种。培养温度32℃。液体外表需7~10d，琼脂固体培养需6~7d。②

三级扩大培养可采用麸曲固体培养、液体外表培养或琼脂固体培养。

所用培养基如下：

a

麸曲培养基：

新鲜小麦麸皮1kg，加水1.1~1.3L。液体培养基与第二级扩大培养基所用液体培养基相同。

b琼脂固体培养基：

与斜面培养基相同。现代工业化大生产主要采用深层通风发酵法。日本约1／5的柠檬酸产品是利用固态发酵法生产的，浅盘发酵法在前苏联、印度、捷克．波兰、保加利亚、阿根廷等国家主要使用，我国、美国及西欧共同体国家那么主要采用液体深层发酵法进行生产3〕

发酵生产

①

工艺流程

以薯干粉为原料的液体深层发酵工艺流程：

斜面菌种→麸曲瓶→种子

↓

薯干粉→调浆→灭菌(间歇或连续式)→冷却→发酵→发酵液→提取→成品

↑

无菌空气

薯渣为原料的固体发酵工艺流程：

试管斜面→三角瓶菌种→种曲

↓

薯渣→粉碎→蒸煮→摊凉接种→装盘→发酵→出曲→提取→成品

↑

米糠

3〕

发酵生产

①

工艺流程

②

柠檬酸的深层液体发酵工艺薯干原料柠檬酸深层发酵工艺米曲汁斜面

茄子瓶种子罐菌丝培养〔也可以孢子接种〕发酵培养〔32℃，5～5.5天〕成熟的发酵液〔或10～20麦芽汁＋0.1%KH2PO4〕16％的薯干粉，α-淀粉酶液化②

液体发酵

a不置换法培养液一次参加，发酵结束后弃去菌盖，发酵液用来提取柠檬酸。具体操作：接种后，培养温度维持在35℃，这是黑曲霉的适宜生长温度，需维持72h左右，以促进孢子发芽及菌体发育。当温度逐渐下降时，必须通人约50℃的空气以维持35℃的培养温度，通风量为3~5m3/m2.h。接种后20h左右可出现灰白色、很薄的菌膜，72h时菌膜已完全形成，菌膜相当厚且有皱褶。48h起由于菌体耗氧增加，可开动另一组风管向盘层之间通汽，进汽温度为40℃左右，风量为7m3/m2.h，进汽湿度为75%以上，以防培养液水分蒸发过快。接种后72h起进入产酸期，这时菌体代谢速率高，耗糖快，发酵液酸度急剧升高，并释放出大量热，最高时可达1000kJ/(m2.h)，此时应加强通风措施，严格将发酵温度控制在26~28℃，以利柠檬酸的形成。因此，一般在进入产酸期前8h左右需增大风量至15~18m3/m2.h，且降低进汽温度在25℃以下，湿度仍在75%以上。160h以后发酵结束。b

置换法置换法一般是采用糖浓度低而营养较丰富的培养液先培养菌盖，待菌盖形成之后再更换发酵培养基。可更换1次也可数次，发酵液用来提取柠檬酸。培养菌盖，一般使用5%的糖液，视糖蜜质量再补充少量NH4NO3、K2HPO4等盐类。接种孢子后，室温保持在34~36℃，培养液品温为32~34℃，使孢子发芽，正常情况下40h即可形成紧密有皱的菌盖。菌盖形成后，放掉培养基，更换发酵培养基(即第1次置换)，并将室温降至30~32℃，待发酵48~60h后再放掉发酵液，参加新培养液即进行第2次置换。如此重复，一般可置换培养基8~10次，总发酵周期为14~20d，收集起来的发酵液，用来提取柠檬酸。置换法的优点是节省了大量培菌时间，发酵速度快，而且原本不适宜长菌的原料都可用作发酵培养基。但为了保持菌盖的高活性，不能将发酵液残糖控制得很低，这样一来就造成替换出来的发酵液其残糖量较高，给后道提取柠檬酸带来困难。c

不置换法影响外表发酵的因素a)

培养液层厚度

培养基液层厚度大，发酵产物总的生成量就大。如果原料质量好，预处理方法得当，曲霉菌丝体活力强，那末可适当增加液层厚度;相反，就应减少液层厚度。c

不置换法影响外表发酵的因素b)

糖浓度

用于外表发酵的糖蜜浓度，质优的糖蜜浓度(以蔗糖浓度计)为18%~22%较适宜，而质劣的糖蜜一般采用14%。在外表发酵中，大约80%的糖被用于合成柠檬酸，菌体生长增殖耗糖8%左右，菌体进行呼吸消耗的糖在10%左右，另有1%~2%的糖用于合成副产物。c)

温度黑曲霉生长最适温度33-37℃，积累柠檬酸的最适温度在32℃黑曲霉适宜产酸温度是26~28℃。温度高，容易形成杂酸等副产物且菌体易衰老；温度低，发酵周期被延长。d)

pH值

黑曲霉长菌的最适pH为中性，而产酸的最适pH在2.5~2.0。因此，应该注意的是：菌盖形成之后，只是在菌盖下面有一个低pH区域，菌体合成柠檬酸的活动都是在这低pH区域内进行的，所以不应该搅动发酵液，防止低值区域的pH值上升而长菌不产酸。黑曲霉发酵柠檬酸，pH3.0以下积累柠檬酸，pH3.0以上积累草酸，pH5.0容易积累葡萄糖酸与不同碳源有关，黑曲霉在合成培养基上产柠檬酸pH2.5