细胞生物学翟中和第三版2

第二章细胞生物学实验技术第一节细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜二、电子显微镜三、扫描隧道显微镜第二节细胞组分的分析方法一、用超速离心技术别离细胞器与生物大分子及其复合物二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法三、特异蛋白抗原的定位与定性四、细胞内特异核酸序列的定位与定性五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态六、定量细胞化学分析技术第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养二、细胞工程第四节用于细胞生物学研究的模式生物第一节细胞形态结构的观察方法光学显微镜：以可见光〔或紫外线〕为光源。电子显微镜：以电子束为光源。一、光学显微镜〔一〕普通光学显微镜1、构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2、原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。R=0.61λ/N．A．其中λ为入射光线波长；N．A：为镜口率＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角〔样品对物镜镜口的张角〕。思考：如何提高显微镜的分辨能力？表一、几种介质的折射率显微镜的几个光学特点：制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。〔二〕相差和微分干预显微技术干预:两列频率相同的光波在空中相遇时发生叠加，在某些区域总加强，在另外一些区域总减弱，出现明暗相间的条纹或者是彩色条纹的现象叫做光的干预。相差显微镜把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的比照度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。1、环形光阑〔annulardiaphragm〕：位于光源与聚光器之间。2、相位板〔annularphaseplate〕：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。用途：观察未经染色的玻片标本微分干预显微镜1952年，Nomarski创造，微分干预显微镜是以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后经过另一棱镜将这两束光集合，从而样品中厚度上的微小差异就会转化成明暗区别，增加了样品反差，造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。微分干预显微镜适于研究活细胞中较大的细胞器，如果接上录像装置可以记录活细胞中的颗粒以及细胞器的运动。〔三〕荧光显微镜特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen〔四〕激光共聚焦扫描显微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。laserconfocalscanningmicroscope,LCSMLCSMImageofaXenopusMelanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)(五)荧光共振能量转移技术CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。

应用:1、检测酶活性变化2、关于膜蛋白的研究3、细胞膜受体之间相互作用4、细胞内分子之间相互作用

(六)荧光漂白恢复技术FRAP(光漂白后荧光恢复)就是在光漂白后对样本确定区中的荧光恢复。FRAP是由没有漂白的荧光团由周围进入漂白区FRAP的运动引起的。FRAP用于测量2-维或3-维分子运动的力度。分子运动包括膜或活细胞内用荧光标明的分子的扩散、转移或其他类型的运动。

二、电子显微镜〔一〕电子显微镜的根本知识1、电子显微镜与光学显微镜的根本区别不同光线的波长２、电子显微镜的分辨本领和有效放大倍数分辨本领：是指电镜处于最正确状态下的分辨率电镜分辨率受制样技术的影响。３、电子显微镜的根本构造１〕电子束照明系统２〕成像系统３〕真空系统４〕记录系统〔二〕、主要电镜制样技术介绍1、超薄切片技术电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅40-50nm的超薄切片，(1)固定：通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水(2)包埋：环氧树脂包埋(3)切片：以热膨胀或螺旋推进的方式切片(4)染色：重金属〔铀、铅〕盐染色形成明暗的黑白图象2、负染技术用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，枯燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。NegativeStainedActin3、冰冻蚀刻freeze-etching亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜〔replica〕。４、电镜三维重构技术对样品在不同的倾角拍照，得到图片经处理后而展现的电子密度图。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学〔StructuralBiology〕〔主要研究生物大分子空间结构及其相互关系〕的主要实验手段。５、扫描电镜技术20世纪60年代问世，用来观察标本外表结构。分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力〔区别荧光屏上距离最近两个光点的能力〕为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。Scanningelectronmicroscope〔SEM〕工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品外表激发出次级电子，次级电子的多少与样品外表结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本外表发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。扫描电子显微镜原理人类精子三、扫描隧道显微镜

scanningtunnelingmicroscope，原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压〔2mV~2V〕，针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。用途：三态〔固态、液态和气态〕物质均可进行观察。扫描隧道显微镜原理第二节细胞组分的分析方法一、用超速离心技术别离细胞器与生物大分子及其复合物转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。转速>25kr/min，离心力>89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。超速离心技术：用途：别离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。可将细胞器初步别离，常需进一步通过密度梯离心再行别离纯化。密度梯度离心用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、别离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。别离活细胞的介质要求：1〕能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2〕PH中性或易调为中性；3〕浓度大时渗透压不大；4〕对细胞无毒。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法１、DNA经1N盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键翻开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反响。Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。２、四氧化锇与不饱和的脂肪酸反响呈黑色，证明脂肪滴的存在，苏丹Ⅲ使脂滴呈深红３、蛋白质定性：米伦反响，重氮反响三、特异蛋白抗原的定位与定性(一)免疫荧光技术将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反响后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。常用的标记物有荧光素和酶。免疫荧光法〔immunofluorescenttechnique〕：常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶标免疫法〔enzyme-labeledantibodymethod〕：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反响后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。间接法原理示意图补体结合法原理示意图(二)免疫电镜技术又称为免疫细胞化学技术是在免疫组织化学技术的基础上开展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三个主要开展阶段。铁蛋白标记技术适用于细胞膜外表抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。酶标记免疫电镜技术是将酶〔主要是过氧化物酶〕与抗体相交联，抗原抗体反响后，加底物显示酶的活性部位，酶反响产物经OsO4处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。但是酶反响产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞外表和细胞内多种抗原的精确定位。胶体金主要具有以下几个优点：〔1〕胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变，可制备抗体-胶体金、蛋白A-胶体金、卵白素-胶体金、植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜；〔2〕在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于识别，定位比酶反响物更精确；〔3〕胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同〔1～150nm〕的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；〔4〕金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；〔5〕胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。此外，胶体金还能用于冷冻蚀刻标本的免疫标记。四、细胞内特异核酸序列的定位与定性具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。〔一〕原位杂交〔insituhybridization〕用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，后来又创造了免疫探针法。〔二〕Southern杂交是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳别离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可识别出与探针互补的特殊核苷序列。将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，那么称为Northern杂交。五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。六、定量细胞化学分析技术〔一〕流式细胞术用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，别离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计〔flowcytometer〕。〔二〕显微分光光度测定技术细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。七、PCR技术PCR即：polymerasechainreaction。反响体系：①样品DNA；②引物〔primer〕，约15-20个核苷酸；③4种dNTP；④TagDNA聚合酶，来自于嗜热水生菌Thermusaquaticus，最适作用温度75~80℃，短时间在95℃下不失活。⑤缓冲体系和Mg2+。反响过程：①变性：约90-95℃；②复性：约60℃左右；③延伸：70-75℃；④重复“变性——复性——延伸〞过程20-30次循环。PCR原理第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养〔一〕动物细胞培养群体培养〔massculture〕：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，集合〔confluence〕后形成均匀的单细胞层；克隆培养〔clonalculture〕：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。转鼓培养法：为制取细胞产品而设计，大容量旋转培养，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中。原代培养〔primaryculture〕：即：培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养〔Passage〕。细胞株〔cellstrain〕：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。细胞系〔cellline〕：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。克隆〔clone〕：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞HenriettaLacksBHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP2／0骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠实验室中常用的几种细胞系〔二〕植物细胞培养外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。AnimalCellCulture二、细胞工程〔一〕细胞融合通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合〔cellfusion〕或细胞杂交。同核体：相同基因型的细胞融合而成。异核体：不同基因型的细胞融合而成。自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。诱导细胞融合的方法：生物方法〔仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒〕、化学方法〔聚乙二醇PEG〕、物理方法〔电击和激光〕。单克隆抗体技术正常淋巴细胞〔如小鼠脾细胞〕具有分泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞〔如骨髓瘤〕可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。〔三〕细胞拆合与显微操作技术１、物理法：用机械方法或短光波把细胞核去掉或使之失活，然后用微吸管吸取其他细胞的核，注入去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。２、化学法：用细胞松弛素B处理细胞，细胞出现排核现象，再结合离心技术，将细胞拆分为核体和胞质体两局部，由于核体外表包有一层细胞质膜和少量的胞浆，因而在PEG或仙台病毒的介导下，核体可与另一胞质体融合，形成重组细胞。第四节用于细胞生物学研究的模式生物生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，用于揭示某种具有普遍规律的生命现象，此时，这种被选定的生物物种就是模式生物。比方，孟德尔在揭示生物界遗传规律时选用豌豆作为实验材料，而摩根选用果蝇作为实验材料，在他们的研究中，豌豆和果蝇就是研究生物体遗传规律的模式生物。模式生物的特点有:1)生理特征能够代表生物界的某一大类群。2)容易获得并易于在实验室内饲养繁殖。3)容易进行实验操作,特别是遗传学分析。4)个体较小,生长繁殖快。生命科学研究中常用的模式生物有：病毒，细菌，酵母，原生动物，黏菌，蛙，海胆，线虫，果蝇，斑马鱼，小鼠１、病毒：１〕特点：结构简单〔壳体和核酸〕进入细胞才能进行复制２〕应用：适合遗传操作，进行有关生物大分子之间的相互作用，基因表达调空肿瘤的发生和防治等研究。作为外源基因的载体，用于蛋白质功能的研究以及肿瘤的基因治疗２、细菌１〕特点：细菌培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱变和别离、鉴定容易转基因技术成熟，进行基因定位简便易行。２〕应用：转基因技术。基因的表达调控３、酵母１〕特点是单细胞生物,可在根本培养基上生长,可通过改变物理或化学环境完全控制其生长在单倍体和二倍体的状态下均可生长,并可在实验条件下控制单倍体和二倍体之间的相互转换,这对其基因功能的研究十分有利有将近31%编码蛋白质的基因或ORF与哺乳动物编码蛋白质的基因有高度的同源性２〕应用：细胞周期调控，P34cdc28突变，细胞停留在G1/SP34cdc2突变，细胞停留在G２/S利用酵母基因突变为基因表达调控，膜泡运输，细胞分化，衰老等研究领域提供研究材料４、线虫１〕特点:通身透明,