红霉素发酵进展

红霉素发酵进展

红霉素发酵水平影响因素红霉素发酵水平主要受工作菌种、培养基组成、发酵条件控制以及后期的分离提纯条件等多方面因素的影响。国内很多科技工作者从红霉素发酵相关参数和调控入手，希望提高红霉素发酵水平。菌种：菌种的选育菌种选育是一门应用科学技术，其理论基础是微生物遗传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌种，从而促进生产发展。1、菌种：菌种的选育目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方法，带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。随着微生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法。例:论文《红霉素高产菌株的选育》以红霉素链霉菌01126为出发菌株,经LiCl和紫外线复合诱变处理,再用含有4种不同结构类似物的培养基定向筛选,获得4株突变株,其中M0359摇瓶效价6876u/ml,比起始菌株(5328u/ml)提高29%,在10t发酵罐上连续6批验证,平均发酵效价7016u/ml,比原生产水平(5652u/ml)提高24%,并且质检全部合格,对生产实际具有重要意义。例:论文《红霉素链霉菌抗噬菌体菌株的选育》

以红霉素链霉菌B-27为出发菌株,采用经过紫外诱变过的孢子悬浮液与噬菌体接触的方法进行处理。结果筛选到一株抗噬菌体高产菌株。通过噬菌体的侵染试验和摇瓶发酵生产能力验证,其抗噬菌体能力十分稳定,红霉素发酵摇瓶效价比对照有所提高。该菌株经纯化后投入生产,有效地控制和预防了噬菌体的污染。菌种选育方向现状：以提高其产生菌种发酵单位为目的的遗传育种工作一直未曾停止。由于对微生物次级代谢产物生物合成的机制了解不多，常规诱变选育的方法存在周期长、效率低和随机性大的缺点，近年来在红霉素高产菌株的筛选方面收效不大。随着分子生物学技术的发展，国际上在红霉素产生菌种的基因工程改造方面进行了诸多尝试；然而，这些研究主要集中在与红霉素产生相关的底物供应或限制因素的改进方面，并未就红霉素生物合成的次生代谢途径做特异性的遗传修饰，因此，在解决红霉素生产中经常面临的有效组分偏低等问题时，缺乏有效的针对性。菌种选育方向作为中科院“百人计划”、国家杰出青年基金获得者，自2007年以来，刘文带领课题组以包括红霉素、阿维菌素、林可霉素、泰乐菌素和螺旋霉素等大宗抗生素产品为对象，就我国抗生素原料药产业普遍存在的问题进行了分析，提出了以组分优化为切入点、采用遗传操作来控制体内合成的化学反应，从而改善产品质量和产量的研究思路。菌种选育方向基于红霉素各组分结构的差异和相互转化的化学本质，他们运用组合生物合成技术的方法和原理对红霉素工业用高产菌株进行了针对性的遗传改良。通过发酵过程中后修饰酶的表达比例调整，他们将无效副产物组分B和C几乎完全转化为有效组分红霉素A，从而在提高了产品质量(基本消除主要的副产物)的同时，有效地提高了产品的产量达25%左右。菌种选育方向抗生素在微生物体内的合成其本质是化学问题，化学过程和机制的解析可以使生物学技术的运用找到合适的目标并发挥更大作用。”刘文表示，“以上是我们构建的第一代红霉素生产重组菌株，主要侧重于品质(组分优化)的提升。目前我们侧重于产量提高的第二代重组菌株已完成中试，结合前两代优势、综合提高质量和产量的第三代重组菌株完成了小试，初步数据表明效果明显。”2、培养基：培养基优化培养基作为微生物养料的直接来源，是影响微生物生命和生理代谢活动的最主要的因素。发酵培养基的要求条件就比较多，要实现产业化生产就要考虑到原料的因地制宜，价格低廉，资源丰富，便于采购运输，适合大规模贮藏，能保证生产上的供应。还要考虑到发酵后的副产物要尽可能的少，而且，所选用的培养基应能满足整体工艺的要求，如不影响通气、提取、纯化及废物处理等等。因此要获得高产量的红霉素，我们要尽可能找到一个最适合其菌种生长的培养基，这包括培养基成分和各组分含量的配比等确定，即对培养基进行优化。目前，响应面法和正交试验法是微生物发酵培养基优化常用的方法。《玉米粉水解物作为红霉素发酵培养基的研究》

试验结果：玉米粉水解物为碳源的发酵单位和发酵指数分别比葡萄糖作碳源提高5.8%和19.0%。玉米粉水解物可同时显著改善发酵液的物理性质,增加装料系数和放罐体积。按目前玉米粉、葡萄糖、成品的市场价格计算原料成本降低21%，综合生产成本26%。《生物氮素在红霉素发酵中的应用研究》生物氮素替代部分黄豆饼粉,从摇瓶试验结果看对发酵水平没有不良影响,合适的替代比例能提高发酵水平;从大生产使用的情况看,使用生物氮素的罐批很少出现提前化稀,放罐时发酵液粘度明显增大,不但有利于发酵的工艺控制和发酵单位的提高、稳定,而且发酵液的预处理也十分有利。此外,其价格相对黄豆饼粉较低,使用量少。因此,生物氮素的应用在提高红霉素发酵水平、降低原材料成本方面是具有潜力的,有良好的推广应用价值。3、发酵条件控制(1)通气和搅拌：发酵罐的通气量一般为1.08一1．2v／(V·min)，增大空气流量和加快搅拌转速会提高发酵单位，但必须加强补料的工艺控制，防止菌丝早衰自溶。(2)温度：采用全程31℃培养，红色链霉菌对温度较敏感，若前期33℃培养，则菌丝生长繁殖速度加快，粘度峰值出现时间早，但衰老自溶亦快。31℃培养菌丝生长虽比33℃慢，粘度峰值出现时间推迟，但衰老较慢，使粘度下降速度减缓，转稀时间推迟。控制参数(3)pH；整个发酵过程维持在6．6—7．2，菌丝生长良好，发酵单位稳定。如在接种后24h内pH过低或偏高，则菌丝生长较慢，生物合成水平的差别也很显著，特别在发酵前期，当pH为5．7—6．3时发酵最终的单位仅为对照的一半。曾用0.2mol磷酸盐缓冲液进行试验，将它加到72h的发酵液内，当PH为5．3时已经生成的红霉家全部失效，菌丝自溶。当PH为6．3时红霉素部分失效，pH在6．7—6．9有利于红霉家的生物合成。(4)发酵液浓度的控制：在一定的强度范围内，红霉素c含量与发酵液浓度呈负相关的关系。因此，适当提高发酵液浓度能减少红霉素c组分的比例，从而保证成品质量。控制参数(5)发酵液热度与搅拌功效、氮源补入量及培养温度有关。通过减慢搅拌转速、改变搅拌叶型式、降低罐温、增加有机氮源补量，滴加氨水等能提高发酵液的浓度。但热度过高会影响溶解氧的浓度，单位明显下降，所以必须因地制宜进行发酵工艺控制。(6)泡沫与消沫：因发酵培养基有黄豆饼粉，故在培养基消毒及通蒸气时泡沫较多。一般以植物油(豆油或菜油)做消沫剂，不宜一次多量加入。发酵过程中参数不控性与模糊控制的应用尽管对发酵过程的环境参数，如PH，发酵温度，溶解氧浓度D0都可以控制得很好，但是由于微生物生长过程是高度的非线性和时变性，关键变量，如菌丝浓度、总糖浓度不可在线测量，使发酵过程的控制问题变得很复杂。采用计算机控制技术对抗生素发酵过程进行实时自动控制、管理和优化操作，不但能解决上述存在的问题，而且可减轻操作人员的劳动强度，提高自动化水平，稳定生产，提高发酵系数，降低原耗与能耗。《基于VB的红霉素发酵过程监控系统的设计》利用VB、MATLAB和SQLSe~er设计了一个红霉素发酵过程的上位机监控系统，能对红霉素发酵过程的温度、pH、溶氧、转速等参数进行数据采集、处理，并采用神经网络算法来预测菌丝浓度、基质浓度和产物浓度，同时根据参数值将相应的控制量传送给下位机来实现对参数的实时控制。该系统具有良好的数据处理能力和图像显示能力，通过监控界面操作，能方便地实现对红霉素发酵过程的实时监控和自动控制，优化生产工艺，提高设备的可用率。《红霉素发酵过程前期参数相关分析及调控》对红霉素发酵过程前期调控策略进行了研究，从宏观代谢流的变化着手，对表征细胞代谢特征的参数进行了相关分析，对发酵前期的摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)及呼吸商(RQ)相关变化及红霉素发酵前期CER与pH的变化进行了分析，确定了合适的调控方式，在工业规模发酵罐上通过控制发酵过程前期补糖速率等措施，使发酵平均水平提升了33.3%《红霉素发酵生产后期的调控研究》在发酵后期向发酵液中加入适量的ATP、硫酸镁、柠檬酸和L2蛋氨酸时,对提高发酵液的生物效价和ErA的相对百分含量有较明显的积极作用.研究发现,每100ml发酵液中添加上述物质的最优组合为:ATP为0.005g、硫酸镁为0.18g、柠檬酸为0.16g和L2蛋氨酸为0.02g。《红霉素生产及其有效组分转化的优化》以红霉素生产菌红色链霉菌HB为研究对象,根据红霉素生物合成机理,以促进甲基化转化和强化基础代谢为主要手段,在利用摇瓶和50L罐发酵生产红霉素的过程中,在大约127h的时候,向发酵液中流加ATP、L-Met、MgSO4和柠檬酸,采用高效液相色谱仪(HPLC)对最终发酵液进行检测,红霉素的有效组分A的相对百分含量由原来的73%提高到88%以上,对最终发酵液进行生物测定,其生物效价亦得到明显提高,实现了红霉素发酵生产的优化。《红霉素A发酵条件的优化》采用两水平因子设计和响应面设计,以红霉素A的相对含量为目标函数建立二项式模型,经Design-Expert6.0.10软件分析得到优化结果：每100ml发酵液中分别补入：

ATP0.00102g、L-蛋氨酸0.01132g、硫酸镁0.0224g、柠檬酸0.0278g、氯化锰0.0034g、L-苏氨酸0.0288g和L-丝氨酸0.0384g时,可使红霉素A相对含量由80.2%提高到89.2%。《有机氮源对红霉素发酵影响的具体分析》本文的研究结果表明红色糖多孢菌在摇瓶中氮源的种类或比例不同,红霉素的效价也明显不同。通过对含有不同氮源培养基的营养成分进行计算,并对其结果进行逐步回归,我们得到黄豆饼粉、棉籽饼粉、啤酒酵母粉和玉米浆等氮源具有的营养成分中Thr是影响效价的主要因子。向发酵水平较低的对照培养基中添加0.05%Thr后红霉素的效价提高了22.85%。《豆油在红霉素发酵中的作用及作用机制的研究》本文通过在红霉素发酵罐基础培养基中添加豆油和发酵过程中进行补加豆油实验发现,补加豆油红霉素效价有明显的提高。发酵罐基础培养基中补加豆油效价可以提高43.1%,发酵过程补加豆油可以使效价提高69.7%。《正丙醇铜离子烟酰胺对红霉素合成的作用》在摇瓶培养过程中,发酵初期加入正丙醇可使红霉素的效价提高49.31%,正丙醇提高了丙酸激酶的比活力,表现出对该酶诱导作用,而对丙酰CoA合成酶比活力无影响。加入铜离子和烟酰胺可使红霉素效价分别提高24%和17%。《钼对红霉素生物合成的影响》在利用糖多孢红色链霉菌HB发酵生产红霉素的过程中，于48h向发酵液中加入钼酸钠，通过对代谢途径关键调控酶活力的测定以及运用高效液相色谱法对发酵液中相关有机酸含量的测定，结论显示：当发酵液中钼酸钠的加入量为0．056g／10mL时，部分代谢流向有利于红霉素生物合成的方向迁移，在一定程度上提高了红霉素的生产速率和产量．《Co2+对红霉素生物合成的影响》研究了红霉素生物合成过程中糖代谢相关的关键酶己糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、磷酸果糖激酶和异柠檬酸脱氢酶,以及合成红霉内酯环