基因分析的基本策略

从上世纪70年代以来，与DNA、RNA操作相关的各种分子生物学技术不断开展，到目前曾经构成了一个庞大而复杂的技术体系。基因操作已成为医学研讨的重要手段。简单地说，基因操作就是一切涉及到DNA、RNA操作的技术。本章主要讨论如何对基因进展定性、定量分析；在随后的2章里分别引见基因功能研讨的技术和基因工程的有关内容。第六章基因分析的根本战略1、需求进展基因的DNA序列分析:序列测定2、基因的染色体上定位：原位杂交技术3、研讨基因在基因组中的拷贝数：SouthernBlot4、研讨基因表达程度：NorthernBlot、逆转录实时PCR技术5、研讨基因表达产物的程度：WesternBlot、流式细胞仪〔FACS〕对一个知或未知基因的内容进展研讨步骤：第一节利用DNA定性、定量分析可从不同角度对基因和基因组进展研讨一、DNA序列测定可以提示基因和基因组一级构造变化DNA测序技术：1、双脱氧链终止法(Sanger法)2、化学裂解法3、PCR测序技术4、全自动DNA测序仪这些技术的发明,都依赖于高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸〔2ˊ,3ˊ-ddNTP〕作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核糖的3ˊ位短少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基构成磷酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷酸链的延伸终止。

假设在DNA的合成反响中，参与一种少量的ddNTP，那么多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反响中，分别参与4种不同的ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将分别终止于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸链进展高分辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。双脱氧测序方法原理根本步骤：1、先将DNA的末端之一标志放射性同位素〔32P、35S〕，2、再将DNA样品分别进展多组具碱基特异性、随机的、不完全的化学修饰；3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断开DNA链；4、经过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小别分开5、根据放射自显影胶片上显示的末端标志片段分布情况，直接读出DNA序列。化学裂解法〔Maxam-Gilbert〕1977反响体系碱基修饰碱基修饰主链断裂断裂点试剂反响试剂

G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶GG+A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G/AC+T肼嘧啶开环六氢吡啶C/TC肼〔加盐〕胞嘧啶开环六氢吡啶C在化学修饰反响中，经过控制反响温度和反响时间，只需一小部分碱基被修饰，随后进展断裂反响也是定量。5`-GATCACTACTG-3`5`*-GATCACTACTG-3`5`*G5`*GATCACTACTG5`*G5`*GA5`*GATCA5`*GATCACTA5`*GATCACTACTG5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACT5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTACGG+AC+TCGA/GC/TC5`*G5`*GA5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTAC5`*GATCA5`*GATCACT5`*GATCACTA5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATCACTACTG硫酸二甲酯甲酸肼肼〔加盐〕DNA自动测序仪上述两种方法都不顺应大规模DNA测定需求。存在操作步骤繁琐、效率低、速度慢的缺陷，特别是读结果的读片过程。1987年发明了一种准确快速的DNA测序方法，即激光测序法和配套的自动测序仪。〔用荧光染料结合引物〕。随后又发明了终止标志系统法。1、提示基因和基因组一级构造变化在医学研讨中具有重要意义。2、经过DNA序列分析，可以鉴定基因和基因组变异。3、经过DNA序列分析，可以鉴定分析人工重组的基因。4、经过DNA序列测定对定点突变进展确认。

DNA序列测定的意义分析基因拷贝数变化一、Southernblot检测基因拷贝数变化Southernblot印迹杂交是指DNA与DNA的杂交，将电泳分别的待测DNA片段转印并结合到一定的固定支持物上，然后用标志的DNA探针检测待测DNA的一种方法。1975年英国爱丁堡大学的Southern建立了该方法，Southern印迹杂交由此得名。Southernblot步骤〔1〕待测核酸样品的制备：提取基因组DNA，并用适当的限制性内切酶消化水解基因组DNA，成大小不一的DNA片段。〔2〕待测DNA样品的电泳分别。〔3〕凝胶中核酸的变性：DNA在制备与电泳过程中DNA片段一直坚持双链构造。电泳终了后DNA变性并转移到适当的固定支持物上才干进展Southernblot。变性通常用碱变性法。〔4〕Southern转膜：将凝胶中的DNA进展碱变性并将PH恢复中性后，即可将凝胶中DNA转移到固定支持物上。固定支持物：硝酸纤维素〔NC〕膜、尼龙膜、化学活化膜和滤纸等。转移方法：毛吸管虹吸印迹法、电转印迹法、真空转移法。〔5〕知序列的DNA探针的制备〔6〕Southern杂交：在将固定于膜上的DNA片段与探针进展杂交前，必需先进展一个预杂交的过程。由于可以结合DNA的膜同样可以和探针DNA结合，在进展杂交实验前，必需将膜上一切能与DNA结合的位点全部封锁。〔7〕杂交结果的检测：采用核素标志的探针或发光剂标志的探针进展杂交时，在杂交洗膜后，将滤膜和X线片装入暗盒，感光后，经冲洗，在X线片上可见黑色条带。1、对某种生物体基因组拷贝数研讨，需求完好提取出基因组，并需求适当的限制性内切酶酶切；2、通常要研讨的基因序列是知的。Southernblot检测基因拷贝数本卷须知二、采用PCR技术也可以分析基因拷贝数原理：细胞内DNA复制是一个复杂过程。参与复制的有多种要素。PCR是在试管中进展的DNA复制反响，PCR原理与细胞内DNA复制类似，但反响体系相对简单。PCR反响体系：耐热的TaqDNA聚合酶、化学合成的寡聚核苷酸引物、4种dNTP、以及适宜的缓冲液体系。PCR反响的根本过程：变性、退火、延伸PCR技术对扩增的模板浓度虽然很低，扩增产量以一个恒定的指数率上升，但经过25至30个循环，产量会到达一个平台期，同时PCR过程中，还会出现“试管效应〞，因些对不同样本量的比较无法直接用PCR技术来鉴定。近年来，随着PCR技术的不断改良，如差别显示PCR和实时PCR的发明，可以用于基因拷贝数的分析。是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾〔polyA〕构造，因此可用含oligo〔dT〕的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。根据PolyA序列起点前2个碱基除AA外只需12种能够性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物；同时为扩增出polyA上游500bp以内一切能够性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进展PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进展Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差别条带鉴定分析，以便最终获得差别表达的目的基因。〔1〕差别显示PCR用于基因拷贝数分析虽然运用

差别显示PCR方法曾经获得了不少成果，而且该方法还在不断改良之中，但它依然存在几个难以处理的问题：但它依然存在几个难以处理的问题：(1)反复率低，至少有20%的差别条带不能被准确反复；(2)假阳性率可以高达90%；(3)获得的差别表达序列极少包含编码信息。〔2〕、代表性差别分析技术该技术是将差减杂交与PCR有机结合构成的一种方法.主要步骤:1、将对照组(driver)和待测组(tester)mRNA逆转录成cDNA片段群,接上接头进展第一次PCR扩增;2、将两组PCR产物片段群用限制性内切酶酶切,构成平均长度256bp的长度.3、将接头消化,在tester组末端接上新的接头,tester组和driver组按1:100比例混合.过量的driver可与tester中互补的部分构成双链.4\复性,按新接头序列设计引物进展第2轮PCR，只需tester和tester杂合体才干和引物配对,大量拉增.实时PCR根据PCR反响动力学特点设计的分析方法。在PCR反响的初始阶段，反响体系中的模板的产物深度较低，而引物是过量的，产物和模板复性不会构成与引物竞争，此时产物含量呈指数添加。当PCR产物积累后，产物的复性可以竞争引物与模板的结合，产物添加减慢，最后进入平台期。所以对样品中的cDNA进展定量分析的最正确时期是反响早期。有人试图依托循环次数减少来分析样品中的cDNA含量，但因样品的差别使之很不可靠。在一定的循环中，mRNA丰度低的样品产量少，能够尚不能检测，丰度高的样品能够已进入平台期，故难以较。〔3〕实时PCR用于基因拷贝数分析实时PCR原理是：在PCR反响体系中参与一种双色荧光标志的寡核苷酸探针，并根据探针上荧光信号的变化计算模板DNA含量。如：TaqMan系统在寡核苷酸探针的5`端标志一个报告荧光染料，3`端标志一个猝灭染料。当光源照射到探针时，被激活的报告荧光染料将能量转移给附近的猝灭染料而不发光。当PCR产物扩增时，聚合酶遇到结合在模板上的荧光探针时，利用聚合酶所具有的5`-3`外切酶作用，将两种染料分别，因此根据报告荧光所发射的荧光强度与被切探针成正比，由此可以计算出PCR产物的含量。实时PCR技术特别适宜于低拷贝基因的定量。实时PCR需求包括热循环仪、计算机、光学仪器用于荧光激发和搜集器、数据处置和分析软件。核酸坚持在细胞或组织切片中，经适当方法处置细胞或组织后，将标志的核酸探针与细胞或组织中的核酸进展杂交，称为原位杂交。原位杂交不需求从组织提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可完好坚持组织与细胞形状，更能准确反映出组织细胞的相互关系及功能形状。三、原位杂交技术可以分析基因在染色体上位置根据检测对象不同可将原位杂交分为细胞内原位杂交和组织切片原位杂交。同时原位杂交既可检测DNA，也可检测RNA，所用探针不同而以。核酸探针根据标志方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。放射性同位素标志探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺陷，非放射性探针可以用生物素、地高辛、荧光素标志探针。〔一〕、固定：坚持细胞构造，最大限制地坚持细胞内DNA或RNA的程度；使探针易于进入细胞或组织。最常用的固定剂是多聚甲醛，其它的固定剂〔如戊二醛〕。〔二〕、玻片和组织切片的处置：包括玻片处置、细胞组织切片的处置、降低背景、预杂交。〔三〕杂交：调整探针的浓度〔0.5～5.0ng/μl〕、探针长度〔50～100个碱基〕、杂交的温度和时间〔四〕杂交后处置：包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。〔五〕显示：根据核酸探针标志物的种类分别进展放射自显影或利用酶检测系统进展不同显色处置。〔六〕结果分析根本方法真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、dsRNA、微小RNA等。目前在上述RNA研讨中，以mRNA研讨最为热点。它的研讨可以提示基因的构造、基因的活性、或基因的变异等。mRNA研讨常用的方法有Northernblot、原位杂交、实时PCR、RNA酶维护实验、cDNA芯片技术和RT-PCR。第二节利用RNA定性定量分析可从不同角度提示基因表达活性Northernblot印迹杂交是指待测RNA样品经电泳分别后转移到固定支持物上，然后与标志的核酸探针进展固-液相杂交。原理同Southernblot。但因Northernblot印迹杂交法检测的是RNA，在外界环境中极易被环境中的RNA酶所降解，因此制备RNA样品时，所需器皿均需求特殊处置。同时作为监测细胞内RNA含量不够准确，只能作为定性分析RNA方法。〔一〕Northernblot定性分析RNA的常用方法RT-PCR是一种以mRNA为模板的体外扩增cDNA的技术。其根本程序是：提取细胞总RNA，然后将其中的mRNA在体外逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，进展特定基因的PCR扩增。由于PCR扩增产物有平台效应，故RT-PCR也普通用于RNA的定性分析。但假设将阳性参照基因作为内参照与待测RNA在一个反响体系中进展扩增，可以对RNA进展相对定量分析。参照基因：β-肌动蛋白〔β-actin〕、3-磷酸甘油醛脱氢酶、rRNA基因等。〔二〕RT-PCR用于定性、定量分析RNA方法三、RNA酶维护实验—了解基因转录后的选择性剪接RNA酶维护实验是利用RnaseA和RnaseT1能专注的降解单链RNA而双链RNA遭到维护的特性，用体外转录合成的放射性核素标志的RNA探针与待检测mRNA进展液相杂交，使RNA探针和待测RNA间在互补序列处构成杂交体，然后用RnaseA和RnaseT1切割此RNA杂交体，遭到维护的RNA经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，从而估计待检测mRNA情况。RNA酶维护实验：可用于①mRNA定量、②mRNA末端定位、③mRNA剪切部位④确定内含子在相应基因中的位置。RNA酶维护实验：全新的mRNA定量分析方法其根本原理是将标志的特异RNA探针〔32P或生物素〕与待测的RNA样品液相杂交，标志的特异RNA探针按碱基互补的原那么与目的基因特异性结合，构成双链RNA；未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化构成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后构成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶维护实验。监测大量基因表达的最好方法之一是cDNA微阵列技术，利用这种技术可以同时测定成千上万个基因的转录活性。cDNA微阵列技术的根本原理与核酸分子杂交方法是一样的。都是运用知核酸序列作为探针与互补的靶核酸序列杂交，经过随后的信号检测进展定性或定量分析基因的表达情况。利用cDNA微阵列能在同一时间内平行分析大量的基因转录产物，进展大量的信息挑选和检测分析。三、cDNA微阵列〔cDNA芯片〕可同时分析大量基因的转录活性目前研讨蛋白质的技术普通多采用免疫印记技术〔Western