重组克隆的鉴定与融合蛋白质的表达、纯化、分析

实验四重组克隆的鉴定与融合蛋白质的表达、纯化、分析IdentificationofRecombinedClonesandExpression,Purification,andAnalysisoftheFusionProtein第一天1.小量质粒DNA提取2.克隆的空载体DNA和重组DNA限制酶切鉴定3.

选定克隆的菌液的离心处理和冻存内容安排第二天1.SDS胶的制备2.纯化表达的6-His融合蛋白3.电泳样品的制备4.SDS电泳5.琼脂糖凝胶电泳、鉴定质粒酶切产物内容安排第三天1.SDS胶的银染显示2.13:30~14:30笔试考试3.凝胶的干燥保存内容安排质粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA原理——碱裂法碱变性法抽提质粒是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH12.6的高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。质粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA原理——碱裂法溶菌酶可破坏菌体细胞壁（溶液Ⅰ），十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶、阴离子去污剂（SDS）和强碱（溶液Ⅱ），处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上。质粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA原理——碱裂法当以pH4.8的KAc高盐缓冲液（溶液Ⅲ），调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。质粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA原理——碱裂法通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。而质粒DNA则留在上清液中，再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。空载体和重组体受体菌质粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA质粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA操作步骤1.细菌培养：（实验老师准备）取试管数只（3只），各加入3mL含氨苄青霉素的LB培养液，从转化的细菌培养皿上分别取单一菌落（2个无绿色荧光；1个有绿色荧光），加入各管中，于37℃150rpm振摇过夜培养。质粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA操作步骤2.质粒的提取（四人一组）（1）取菌液（三种）各1.2mL于小离心管中，10000r/min离心1min去掉上清液。加入150μL的溶液Ⅰ，充分混悬细菌，在室温下放置10min。（2）加入200μL新配置的溶液Ⅱ。加盖，颠倒5次使之混匀。冰上放置5min。质粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA操作步骤（3）加150μL冷却的溶液Ⅲ，加盖后颠倒混匀，冰上放置15min。10000r/min离心5min，上清液（400μL）转入另一离心管中。（4）向上清液中加入等体积苯酚/氯仿，震荡混匀，10000r/min离心2min，将上层水相转移至新的离心管中。质粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA操作步骤（5）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置2min。离心5min，去上清，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。（6）加1mL70%乙醇，震荡并离心，倒去上清液，晾干，加入20μL的TE缓冲液，使DNA完全溶解，待用。限制酶切鉴定重组质粒

IdentificationofrecombinantPlasmidbyRestrictionDigestion操作步骤1.限制酶切（每组取3只1.5mL离心管）每管反应体积20μL，每管加提取的质粒DNA液5μL，再加入酶切反应混合液15μL。混匀后置37℃温浴，酶切过夜。DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒反应完毕各加入3μL10×LoadingBufferM12第一组第二组3412341.空载体，2.空载酶切，3.重组体，4.重组体酶切Ion-exchangeChromatographyAffinitychromatography6His标签重组蛋白纯化原理重组蛋白质中成串组氨酸残基（一般六个组氨酸残基相连）可以与金属镍螯合物特异结合，这一特性目前常常被用来进行重组蛋白质的纯化。6His标签重组蛋白纯化原理原核表达重组蛋白质纯化，根据重组蛋白质变性与否可分为：非变性纯化（nativeconditions）和变性纯化（denaturingconditions）；按操作的方法可分为：批纯化（batchpurification）和柱纯化（columnpurification）。6His标签重组蛋白纯化原理此类蛋白质纯化技术属于固化金属离子亲和层析（immobilized-meatalaffinitychromotagraphy，IMAC），利用组氨酸残基中所含的串联咪唑基团与固化金属离子可以螯合形成配位键的特性纯化重组蛋白；6His标签重组蛋白纯化原理先通过固化于基质（常用为琼脂糖）的金属离子及其载体与带有6His标签重组蛋白结合，无6His标签的蛋白理论上不与之结合，经洗脱液洗脱非特异性亲和蛋白质后；再用高浓度咪唑溶液将带有6His标签重组蛋白从其结合的基质上洗脱下来，达到分离、纯化重组蛋白质的目的。6His标签重组蛋白纯化原理Interactionbetweenneighboringresiduesinthe6HistagandNi-NTAmatrix6His标签重组蛋白纯化原理Ni-NTA-Agarose6His-tagBindingResin6His标签重组蛋白纯化原理6His标签重组蛋白纯化原理组氨酸（Histidine）咪唑（Imidazole）ChemicalstructuresofHistidineandImidazole

柱纯化（columnpurification）批纯化（batchpurification）Purificationof6Histaggedproteinsusingthespincolumnprotocol小量重组蛋白纯化用离心套管阳性重组体筛选后培养

（实验老师准备）1.选取含阳性重组体的大肠杆菌置于含Amp培养基过夜培养2.次日，向培养基中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，于30℃继续培养3h。3.以未加IPTG的细菌作为未诱导对照。6-His融合蛋白的分离纯化

IsolationandPurificationof6-His-Fusionsprotein2.超声波破裂细菌（实验老师准备）①未加IPTG的细菌裂解液标记为1号管（未诱导）②经IPTG诱导的细菌裂解液标记为2号管（诱导）

第二天操作步骤3.His-BindResin柱的预处理：（实验老师准备）在1.5ml离心管中加入100μLHis-BindResin，加入200μLWashingbuffer，10000rpm离心30秒，去上清，重复2次。每组准备一只处理好的Ni2+柱，柱体积50μL。平衡后的Ni2+柱移置纯化管内第二天操作步骤4.6-His融合蛋白的纯化1）上样：将细菌裂解上清液0.6mL（预留100μL做蛋白浓度测定及上样，2号管）转移入处理好的Ni2+柱（50μL柱体积）中，充分混匀10min。（持续颠倒混匀）将混好的上清液及Ni2+柱转移入纯化柱中，10000rpm，30秒，收集滤出的液体（标记为3号管）。第二天操作步骤2）清洗非特异性结合蛋白：将纯化柱套入收集管中。在柱内加入（5倍柱体积）500μLWashingbuffer，剧烈震荡，10000rpm，30秒，收集滤出的液体（标记为4号管）。再重复洗两次，收集滤液标记为5、6号管第二天操作步骤3）洗脱靶蛋白将纯化柱分别套入新的1.5mL离心管中。在柱内各加入200μLElutebuffer，指弹混匀室温放置5min，10000rpm，30秒，收集滤出的液体（标记为7号管,即纯化靶蛋白）。第二天操作步骤5.样品准备1号管蛋白样品通过定量后，大胶上样量60μg，小胶上样量30μg；2号管大胶70μg，小胶上样量35μg；3至7号管上样体积与2号管相等，加入4×上样buffer混匀。95℃加热10min，为电泳样品。第二天操作步骤除电泳分离胶浓度增加至12%外，其他步骤同前。（参照实验一）凝胶厚度统一为：1mmSDS电泳胶制备第二天操作步骤SDS电泳胶制备1.胶模准备与灌胶：配分离胶（12%）：取一个100ml烧杯，加入以下成分:第二天操作步骤

分离胶缓冲液（pH8.8）2.5mL40%丙烯酰胺胶液3mLH2o4.4mL10%过硫酸铵0.1mL轻摇混匀后，8μLTEMED，再次混匀后立即加入玻板中。P.85.表2-19，10ml/块胶第二天操作步骤压缩胶浓度（5%）

压缩胶缓冲液（pH6.8）1.25mL40%丙烯酰胺胶液0.625mLH2o3.075mL10%过硫酸铵50mL轻摇混匀后，8μLTEMED，再次混匀后立即加入玻板中。P.85.表2-19，5mL/块胶SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2.上样电泳：40-50V电压电泳过夜。第二天操作步骤1号2号3号Marker4号5号6号7号LoadingbufferLoadingbufferSilverstainingstocksolutions第三天操作步骤第三天操作步骤第三天操作步骤第三天操作步骤第三天操作步骤蛋白质电泳胶的银染色显示方法

Silver-StainingDisplayofProteinElectrophoresisGel操作步骤：（注意：进行任何操作时，手都不可以触及胶面，必须戴手套，只能接触凝胶溴酚蓝前沿部分，避免手指纹污染蛋白质胶面）

1、固定漂洗：待电泳完毕，关闭电源，断开连接导线；倾去电极液，卸下胶膜；取下分离胶胶块浸泡入5体积（50ml）蒸馏水，快速漂洗后，加入5体积的Silverstainingfixingsolution振摇30min，速度以胶块略微浮起为好；（步骤1,2等待期间琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切质粒）第三天操作步骤2、致敏：去除固定液，用5体积的Sensitizingsolution，振摇30min；3、漂洗：加入5体积的蒸馏水，振摇5分钟，去除液体后重复2次漂洗；4、染色：加入5体积Silversolution，振摇20min（避光）。5、再漂洗：加入5体积的蒸馏水，振摇1分钟，去除液体后重复1次漂洗；第三天操作步骤6、显色：加入5体积Developingsolution，振摇至胶块中色带清楚，（一般10min以上，显色时间依水的纯度不同而有差异），而背景略呈淡黄色；7、终止：立即倾去显色液体，加入5体积Stoppingsolution终止反应。照相或干胶保存结果。第三天操作步骤实验预做结果质粒DNA过夜酶切第三天实验预做结果1.1号管（未诱导）；2.2号管（诱导过柱前）；3.3号管（过柱后）；4.Marker；5-7.4号，5号，6号管（washbuffer清洗非特异结合蛋白）；8.7号管（elutebuffer洗脱靶蛋白）背景知识目的基因pKCε部分片段1.1kb实验原理蛋白激酶C

目前为止，在哺乳动物组织内已确定10种PKC亚类，分为A、B、C三组，A组称为典型或传统的PKC（classicalorconventionalPKC,CPKC），包括α、βI、βⅡ和γ亚类，其中βI和βⅡ有高度的同源性，是由同一mRNA的不同剪接而成，A组成员分子量在76-78kDa。B组为新型PKC（atypicalPKC,aPKC），包括δ、ε、η（L）和θ亚类，分子量在77-83kDa。C组为非典型PKC（atypicalPKC,aPKC），由ζ和λ亚类组成，分子量较小为67kDa。实验原理哺乳动物组织内的PKC亚类亚

类氨基酸残基分子量（kDa）激

活

剂表达组织A组：经典PKC

α67276PS、Ca2+、DAG、FFA、LysoPC广泛βI67176同

上某些组织βⅡ67376同

上多种组织γ69778同

上脑B组：新型PKC

δ67377PS、DAG广

泛ε73783PS、DAG、FFA脑

等η（L）68377？肺、皮肤、心脏θ70781？骨骼肌C组：非典型PKC

ζ59267PS、FFA广

泛λ58667？卵巢、睾丸等实验原理载体pUC18-GFP：3.4kbGFPampr实验原理重组体pUC18-GFP-pKC：4.5kbGFPpKCεampr6-HisUAG6-HispKC表达产物：融合蛋白（40KD)实验原理HindⅢ12435酶切鉴定的原理重组体上有3个HindⅢ的酶切位点正向：1+2(1.3kb)；3+4(430)；5反向：1+3(790)；2+4(950)；5空载：1+4(620)；5实验原理1（490）；2（820）；3（300）4（130）；5（2.7kb）绿色荧光蛋白（GFP)

绿色荧光蛋白-发现日本科学家下村脩1962年在普林斯顿大学做研究的时候，从一种特殊水母中提取水母素时，偶然发现一种在紫外光下可以发强烈绿色的蛋白─绿色荧光蛋白(GFP)。发光原理其基因可在异源组织中表达并产生荧光，GFPcDNA开放阅读框架长度约714bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸－脱氢酪氨酸－甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基团，在长紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。实验原理GFP的优点

(1)易于检测。GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。

(2)荧光稳定。GFP对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照GFP在pH7~12范围内也能正常发光；对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数都有较强抗性。’

(3)无毒害。从目前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞仍可连续传代。实验原理GFP的优点(4)通用性。表现在GFP的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光。(5)易于构建载体。由于GFP分子量较小，仅为27~30kD，编码GFP的基因序列也很短，为2．6kb，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。实验原理(6)可进行活细胞定时定位观察。对活细胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真实的状态。通过GFP可实时观察到外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助于近来广泛使用的激光扫描共聚焦显微镜，结合强大的计算机软件，可进行三维显示。(7)易于得到突变体。GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体，且增强了荧光强度，适合在不同物种中专性表达实验原理GFP的应用

研究基因表达的调控元件和蛋白定位。

•研究基因表达的时序控制与空间定位。

•发育分子机理研究。GFP可以作为活体标记，在原位观察细胞的生长和运动。特别对于身体透明的动物观察起来更方便。

•筛选药物。由于可以用不同颜色的GFP衍生物标记相关的蛋白，来观察单细胞内相互作用的靶蛋白，再分离出目的细胞，从而可用于大规模药物筛选。