临床免疫学检验课件

第一章概论

免疫学（immunology)是研究免疫系统的结构与功能，了解其在免疫应答反应中对机体有益的防卫功能和有害的病理损伤机制，研究有效的免疫措施，实现以防病、治病为目的的一门现代医学学科基础免疫学：从生物学、分子生物学和遗传学的角度，研究免疫系统的组织结构、生理功能、信号传导及调节等。临床免疫学：应用免疫学的基础理论和技术研究疾病的机制、诊断、治疗和预防。第一节免疫学简介免疫功能免疫防御免疫自稳免疫监视免疫应答抗原机体抗体致敏淋巴细胞二、免疫组织与器官三、免疫细胞1、T淋巴细胞TCR-CD3复合物是T细胞抗原受体与一组CD3分子以非共价键结合而形成的复合物，是T细胞识别抗原和转导信号的主要单位。TCR可分为TCRαβ和TCRγδ两种类型CD4和CD8既能加强T细胞与APC或靶细胞的相互作用，又能参与抗原刺激TCR-CD3分子信号转导协同信号分子参与T细胞活化的协同刺激信号主要是CD28--CD80/86，CTLA4--CD80/86给予已活化T细胞抑制信号。CD40-CD40L结合与B细胞的活化、记忆性B细胞形成和阴性、阳性选择有关2、B淋巴细胞B细胞主要的三个功能：产生抗体、提呈抗原、分泌细胞因子参与免疫调节BCR复合物的组成BCR-Igα/Igβ形成B细胞的识别单位，Igα/Igβ作用是转导抗原与BCR结合产生的信号和参与mIg链的表达与转运替代性BCR复合物表达于Pro-B和Pre-B细胞。参与B细胞活化及免疫应答的其他分子

B细胞活化辅助受体CD19-CD21协同刺激分子CD40-CD40L补体受体CD35、CD21其他膜分子CD22、CD20、CD323、NK细胞

4、吞噬细胞及其作用吞噬杀伤和清除作用分泌细胞因子和其他炎性介质加工处理提呈抗原，启动特异性免疫应答抗肿瘤作用

四、免疫分子1、免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。免疫球蛋白的结构人类Ig根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，其重链分别为：γ、α、μ、δ、ε轻链可分为两型：κ、λ型二、免疫球蛋白的功能区每个功能区约由110个氨基酸组成，其氨基酸的序列具有相似形或同源性。其二级结构是反向平行的β片层IgG于出生后3个月开始合成IgG多为单体，半衰期约为23天，占血清免疫球蛋白总量的75%～80%IgG1、IgG2和IgG3的CH2能通过经典途径激活补体一、IgG五类免疫球蛋白的特性与功能IgG是唯一能通过胎盘的抗体通过Fc段与吞噬细胞表面FcR结合，发挥调理作用；与K细胞结合，发挥ADCC作用；与葡萄球菌A蛋白结合。具有抗菌、抗毒和抗病毒作用参与II、III型超敏反应为五聚体，是分子量最大的Ig，称巨球蛋白。IgM激活补体能力比IgG强天然血型抗体是IgMIgM是个体发育过程最早能产生的抗体，胚胎晚期已能合成，新生儿脐带血中若IgM水平升高，表示该儿曾有宫内感染二、IgMIgM是抗原刺激后出现最早的抗体，故检测IgM水平可用于传染病的早期诊断。IgM是B细胞抗原受体的主要成分也可参与II、III型超敏反应分为血清型和分泌型两种，血清型IgA主要由肠系膜淋巴组织中的浆细胞产生。而分泌型IgA（SIgA）是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等处的固有层中浆细胞产生。主要存在于初乳、唾液、泪液，以及呼吸道消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。分泌型IgA的合成和主要作用部位在黏膜三、IgAIgD是B细胞的重要表面标志B细胞的分化过程中首先出现SmIgM，后来出现SmIgD，他的出现标志着B细胞成熟了。四、IgD又称亲细胞抗体CH2和CH3功能区可与肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的高亲和力Fcε受体结合，引起I型超敏反应五、IgE2、补体系统补体：是存在于人和脊椎动物血清与组织液中一组经活化后具有酶活性的蛋白质3、细胞因子细胞因子(Cytokine,CK)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称。细胞因子介导多种免疫细胞间的相互作用有多种其他名称：单核因子、淋巴因子、集落刺激因子等细胞因子的共同特性是低分子量（15~30kD）的蛋白或糖蛋白；天然的细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞分泌；且多以单体形式存在；以非特异性方式发挥作用；以较高的亲和力与其受体结合；细胞因子的分泌是一个短时自限过程。细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞也可产生一种或几种相同的细胞因子；一种细胞因子可对多种靶细胞发挥作用，产生多种不同的生物学效应，称多效性；几种不同的细胞因子也可同一种靶细胞发生作用，产生相同或相似的生物学效应，称重叠性；一种细胞因子可以抑制另一种细胞因子的某些生物学作用，表现为拮抗效应；可以增强另一细胞因子的某些生物学作用表现为协同效应。第二节细胞因子的分类和生物学活性细胞因子的种类：白介素在白细胞间发挥作用的细胞因子；干扰素具有干扰病毒感染和复制的能力；肿瘤坏死因子一种能使肿瘤发生出血坏死的物质；集落刺激因子指能刺激多能造血干细胞和不同发育分化阶段的造血干细胞进行增殖分化，并在半固体培养基中形成相应集落的细胞因子；生长因子具有刺激细胞生长作用的细胞因子；趋化性细胞因子由白细胞与造血微环境中的基质细胞分泌，可结合在内皮细胞的表面，具有对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的趋化和激活活性。4、白细胞分化抗原和黏附分子白细胞分化抗原概念指血细胞在分化成熟为不同谱系、分化的不同阶段及细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记分子。CD应用以单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原称CD黏附分子是众多介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互接触和结合分子的统称。黏附分子以受体-配体结合的形式发挥作用，参与细胞的识别、活化和信号转导、增殖和分化、伸展与移动。根据结构特点分为：整合素家族、选择素家族、免疫球蛋白超家族、钙粘蛋白家族和未归类的黏附分子功能免疫细胞识别中的辅助受体和协同活化信号炎症过程中白细胞和血管内皮细胞黏附淋巴细胞归巢第二节临床免疫学临床免疫学：应用免疫学的基础理论和技术研究疾病的机制、诊断、治疗和预防的分支学科。免疫病理和免疫性疾病移植免疫学肿瘤免疫学生殖免疫学精神免疫学第三节免疫学检验免疫检验的一个重要组成部分是研究免疫技术在临床领域的应用。第一节抗原抗体反应的原理

抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。物质基础:

抗原表位与抗体高变区间的互补结合抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合抗原抗体之间的结合力亲水胶体转化为疏水胶体静电引力（electrostaticforces）范德华引力:作用最小（vanderWaalsinteractions）氢键:最具特异性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）

抗原抗体结合力示意图一、抗原抗体结合力抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在着的引力，是抗原抗体间固有的结合力亲和力(affinity)抗原抗体亲和力示意图二、抗原抗体的亲和力和亲合力抗体结合部位与抗原表位之间结合的强度亲合力(avidity)抗原抗体亲合力示意图

可见反应抗原抗体复合物

(疏水胶体)电解质

抗原(亲水胶体)

抗体(亲水胶体)

+三、亲水胶体转化为疏水胶体第二节抗原抗体反应的特点特异性可逆性比例性阶段性特异性：抗原与抗体结合反应的专一性抗原抗体反应特异性示意图分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性一、特异性两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应交叉反应（crossreactions）抗原抗体交叉反应示意图二、可逆性可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性影响因素：抗体对相应抗原的亲合力－亲合力越高，结合越牢固，越不易解离环境因素对复合物的影响－pH、离子强度

前带(prezone)：抗体过量后带(postzone)：抗原过量等价带(equivalencezone)：

抗原抗体比例合适

抗原抗体反应比例性示意图比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系三、比例性第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象四、阶段性第三节影响抗原抗体反应的因素抗原、抗体反应物的自身因素环境因素一、反应物自身因素抗原:理化性状、表位种类和数目抗体:来源、特异性、亲和性、效价电解质:生理盐水或缓冲液酸碱度:pH6～pH9温度:15℃～40℃，37℃最适二、环境因素反应类型实验技术结果判断凝集反应直接凝集试验观察凝集现象间接凝集试验同上抗球蛋白试验同上沉淀反应液相沉淀试验观察沉淀，检测浊度免疫电泳技术观察扫描沉淀峰、沉淀弧补体参与的反应补体溶血试验观察测定溶血现象补体结合试验同上第四节免疫学检测技术的类型反应类型实验技术结果判断中和反应病毒中和试验检测病毒感染性毒素中和试验检测外毒素毒性标记免疫反应荧光免疫技术检测荧光现象放射免疫技术检测放射性强度酶免疫技术检测酶底物显色发光免疫技术检测发光强度金免疫技术检测金颗粒沉淀第一节免疫原的制备

免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体或致敏性淋巴细胞的抗原颗粒性抗原－细胞、细菌、寄生虫可溶性抗原－蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸细胞抗原：绵羊红细胞细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原寄生虫体抗原：虫卵一、颗粒性抗原的制备组织细胞抗原的制备：高速捣碎法－组织捣碎机捣碎研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨

（一）可溶性抗原的制备二、可溶性抗原的制备和纯化

组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备：

反复冻融法－-20℃冻结，然后室温融化超声破碎法－超声波（1～20kHz）自溶法－自身酶系酶处理法－溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶表面活性剂处理法－SDS、去氧胆酸钠、二乙基十六烷基溴

1.超速离心法：差速离心法－低速和高速离心交替进行密度梯度离心法－区带离心法（二）可溶性抗原的纯化2.选择性沉淀法：核酸去除法－氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素盐析法－硫酸铵、硫酸钠有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮聚合物沉淀法－聚乙二醇

4.离子交换层析法：利用蛋白质带电荷不同进行分离离子交换剂：

离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂

3.凝胶过滤法（层析法）：利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进行分离

5.亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力

(1)亲和层析支持物的选择：①非特异性吸附低；②液体流速快；③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定；④有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结合；⑤有丰富的微孔，以增加结合容量。最常用的支持物是Separose4B

(2)配体的选择条件：①抗原或抗体必须单一特异性；②抗原与抗体必须具有较高的亲和力；③配体必须有一个适当的化学基团。6.电泳法：

利用分子量和电荷量不同进行分离

（三）纯化抗原的鉴定蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法分子量测定：SDS、凝胶过滤纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、SDS、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、ELISA三、免疫球蛋白片段免疫原的制备免疫球蛋白具有抗原性，也可作为免疫原免疫动物制备抗体应用免疫球蛋白片段的制备：非共价键解离法－改变pH、利用强变性剂共价键解离法－氧化法和还原法溴化氰裂解法酶解法－木瓜酶、胃蛋白酶

四、人工抗原的制备

半抗原(hapten)：仅有抗原性而无免疫原性的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等载体(carrier)：赋予半抗原以免疫原性的物质1.人工结合抗原①蛋白质：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白牛甲状腺球蛋白血蓝蛋白②多肽聚合物：多聚赖氨酸（polylysine）③大分子聚合物：羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose,CMC)

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,PVP）

载体四、人工抗原的制备2.人工合成抗原MBL结构四、人工抗原的制备3.基因重组抗原破伤风毒素C基因片段的PCR结果

SDS和Westernblot分析纯化的重组表达产物

免疫佐剂免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。

化合物:氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80、弗氏不完全佐剂以及人工合成的多聚肌苷酸∶胞苷酸(polyI∶C)、脂质体生物制剂:处理改造的细菌及代谢产物，如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌及CTB、LPS和类脂A、胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋白用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、polyI∶C、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freund’sadjuvant)

一、佐剂的种类弗氏佐剂(Freund,sadjuvant)：弗氏完全佐剂－羊毛脂与液体石蜡的混合物弗氏不完全佐剂－弗氏完全佐剂加卡介苗乳化方法：研磨法和搅拌混合法

改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统。刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。刺激淋巴细胞增殖和分化。

二、佐剂的作用机制图2:Mannan-OVA偶联物的SDS(10%)分析1:Proteinmarker2:OVA3:Mannan4:Mannan-OVA1234第三节抗血清的制备

抗血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体多克隆抗体的产生示意图多克隆抗体(polyclonalantibody,pcAb)：天然抗原刺激多种B淋巴细胞克隆产生的多种抗体的混合物

抗原来源与动物种属的关系

种属差异越远，免疫原性越强

动物个体的选择

适龄、健康、体重符合要求

抗原的性质一、免疫动物的选择免疫原的剂量

中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体

免疫间隔时间

第一次和第二次间隔10～20天，三次及以后间隔7～10天免疫途径

皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结

二、免疫程序颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊

心脏采血法：

家兔、豚鼠、大鼠、鸡

静脉采血法：

家兔、山羊、绵羊

三、动物采血法抗血清的纯化

抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂抗体干扰试验结果。盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法凝胶过滤法：常结合盐析法离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维素亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose4B制成亲和层析柱

一、IgG类抗体的纯化亲和层析法：杂抗原交联Sepharose4B柱吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗原混合液制成固相吸附剂二、单价特异性抗血清抗血清的鉴定和保存抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法抗体效价的鉴定：凝集试验、双向免疫扩散试验、ELISA抗体纯度的鉴定：SDS、双向免疫扩散试验、免疫电泳抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验

一、抗血清的鉴定2℃～8℃保存：短期保存冰冻保存：保存5年真空干燥保存：保存5～10年二、抗血清的保存

第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术原理：聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细

胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤

细胞系单克隆抗体生成：接种杂交瘤

细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体

CésarMilsteinGeorgesJ.F.Köhler1946～19971922～2002抗体种类：第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体流程一、杂交瘤技术（次黄嘌呤磷酸核糖转化酶）胸腺嘧啶核苷激酶不产生Ig的重链和轻链HGPRT-;TK-

次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶与提供淋巴细胞的动物品系相同（一）小鼠骨髓瘤细胞

动物：BALB/c小鼠7～12周龄20g～25g体重（二）免疫脾细胞细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫免疫小鼠。淋巴细胞。浆细胞培养液：RPM1640培养液DMEM培养液（三）细胞融合细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃或液氮及干冰中免疫脾细胞的制备：1×108的淋巴细胞无菌手术饲养细胞：细胞密度过低不利于细胞生长繁殖常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞其中MQ还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化。饲养细胞骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)50%PEG1min内加完;2min内加10ml培养液融合方法SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～51ml50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7天，换用HT培养液细胞融合10～20天出现克隆HAT筛选挑克隆融合细胞的早期培养HGPRT酶与TK酶：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）杂交瘤细胞的选择性培养应用液：8-杂氮鸟嘌呤聚乙二醇HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNAHAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻SP2/O:HGPRT-，TK-;长命脾细胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)杂交瘤细胞:HGPRT+，TK+;长命骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞杂交瘤细胞：长期生长繁殖利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力有限稀释法(limitingdilution)

显微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂平板法(softagarmethod)

二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.5～1个细胞有限稀释法效率最高价格昂贵FACS配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml)+细胞冻存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义

第二节单克隆抗体的制备

经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。一、单克隆抗体的产生动物体内诱生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只体外培养法：中空纤维培养系统

单抗含量不高，牛血清Ab难以去除腹腔注射法前5天进行,预先腹腔注射pristane（1～5）×106细胞1～3w形成腹水高滴度腹水二、单克隆抗体的纯化腹水或细胞上清液

滤纸去掉脂质和大颗粒

离心去除细胞碎片和蛋白聚合物

盐析

凝胶过滤

离子交换层析

辛酸提取

亲和纯化法

最有效

盐析沉淀亲和层析离子交换层析McAb的纯化Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的交叉反应效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示

表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞

争抑制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条McAb靶抗原分子量：常用westernblot三、 单克隆抗体的性质鉴定四、单克隆抗体的特性高度特异性高度的均一性和可重复性弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性（一）单克隆抗体的特性优点：在体外“永久”地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗（二）单克隆抗体的优点与局限性局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高

McAb

PcAb

抗原要求可以不纯纯度高得量高低特异性高低

稳定低高沉淀反应无有成本高低McAb与PcAb的比较McAbandPcAb第四节单克隆抗体的应用检验医学诊断试剂蛋白质的提纯小分子抗体的应用抗体融合蛋白的应用双特异抗体的应用抗体库技术的应用和前景病原微生物抗原、抗体的检测肿瘤抗原的检测免疫细胞及其亚群的的检测激素测定细胞因子的测定一、检验医学诊断试剂病原体测定：肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH－弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒，单纯疱疹病毒细胞表面CD测定：CD4/CD8:Th/Tc白血病的分型激素的测定：

内分泌疾病的诊断药物测定(TDM)：抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛研究工作中的探针：越来越多未知功能cDNA的克隆对复杂的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加第三节基因工程抗体制备基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)

根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。

将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体一、人源化抗体方法：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力（一）嵌合抗体定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAb亦叫“重构型抗体”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR移植抗体意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗（二）改型抗体Fab：抗原结合片断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片段SdAb：单区抗体

二、小分子抗体小分子抗体许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。四、双特异性抗体定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性

五、噬菌体抗体库技术用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人（一）基本原理和程序噬菌体抗体库从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA；应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段；构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surfacedisplayantibodylibrary)常用载体；表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。构建噬菌体抗体库模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA通用引物具有人的种属普遍性抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性（二）噬菌体抗体库技术的特点避开了人工免疫和杂交瘤技术抗体库的大容量抗体库极高的筛选效率可获得高亲和力的人源化抗体VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程所用的抗体基因又来自人体六、抗体库技术的应用和前景在肿瘤体外诊断中的应用在肿瘤诊断中的应用在肿瘤治疗中的应用

思考题试述B淋巴细胞杂交瘤选择培养基的原理。基因工程抗体有哪些类型？B淋巴细胞杂交瘤的骨髓瘤细胞具备哪些特点？小结

杂交瘤单克隆抗体制备技术的原理是利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细

胞与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一

体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）,最终获得既能产生所需单克隆抗体,又能不断繁殖的杂交瘤

细胞系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。一、基本原理

1.双抗体夹心法(测HBsAg、HBeAg)抗-HBs-HBsAg-抗HBs-HRP复合物抗-HBe-HBeAg-抗HBe-HRP复合物颜色深浅与量成正比酶结合物待检血清底物2.竞争法(测HBeAb、HBcAb)HBeAb－－中和竞争法颜色深浅与量成反比加底物显色待检血清酶结合物中和试剂HBcAb－－抑制竞争法底物颜色深浅与量成反比酶结合物待检血清二、实验材料1.市售成套检测试剂盒2.待检血清试验准备：从冷藏环境中取出试剂盒，在室温下平衡30分钟，同时洗涤液做1:20稀释。对待测的样品进行编号加待测标本：每孔加入50μl，并设阳性对照1孔，阴性对照1孔，空白对照1孔。HBcAb检测前需要将血清稀释30倍（生理盐水）。加酶结合物，每孔50μl，空白孔不加，充分混匀，置37℃孵育30分钟。洗涤，弃去孔中液体，用洗涤液洗3次，每次静置5秒，于吸水纸上充分拍干。加显色剂，先加显色剂A、B各一滴，放置37℃避光孵育15分钟。终止反应：每孔加入终止液50μl，混匀。三.1检测HBsAg、HBeAg、HBcAb操作方法准备加样加酶结合物洗涤加显色剂AB加入终止液温育温育三.2检测HBeAb操作方法HBeAb检测时加中和试剂一滴准备加样加酶结合物洗涤加显色剂AB加入终止液温育温育四、结果判断

HBsAg、HBeAg结果判断:

显色阳性不显色阴性HBeAb、HBcAb结果判断:

显色阴性不显色阳性1、肉眼判定2、酶标仪判定测定OD450值五、注意事项1、从冷藏环境取出的试剂应置37度平衡30分钟后使用2、试剂使用前应摇匀，弃去1一2滴后垂直滴加3、洗涤时，将洗涤液注满每孔，静置10秒钟，弃去孔内液体拍干，如此反复5次4、本试剂盒及临床样本均应视为有潜在传染性，严格无菌操作规则；有任何试剂接触皮肤和眼睛，用大量清水清洗5.终止液为硫酸，具有腐蚀性7.空白孔、阴性对照孔、阳性对照孔设置顺序8.空白对照应加的试剂有：显色剂AB各50ul，终止液50ul思考题分析可能影响实验的因素。复习实验结果的临床意义。2.双抗原夹心法(测HBsAb)HBsAg-抗-HBsAg-HBsAg-HRP复合物颜色深浅与量成正比1、关于抗HBc稀释与否的问题：我国境内所开发和使用的试剂盒，基本都是要求进行一定倍数稀释的，最为主要的原因是我国是乙肝大国，按照1992-1995年全国病毒性肝炎流行病学调查结果乙型肝炎病毒核心抗体（抗－HBc）阳性率为49.8％，抗-HBc作为HBV感染指标存在时间很长甚至终生携带，但抗-HBc低度在不同感染时期确存在很大差异，感染转归后抗-HBc一直低低度持续存在，因此流行病学上把低低度抗-HBc作为HBV既往感染的一个指标，另一方面HBV感染现症病人抗-HBc低度一般情况下都比较高，卫生部临床检验中心根据人群抗-HBc低度情况对流行病学意义和诊断意义的低度进行了相关规定。

2、关于操作复杂的问题：这是一个科学的问题以及对病人负责的问题，事实上试剂生产厂家在研发该试剂时候，进行了大量实验，包括对稀释比例等条件进行了比较细致的摸索，要想得到相对准确的就结果，原则上必须遵循说明书的相关要求。临床都应该稀释做的,即使你是做体检,用原倍的一般只适合流行病学,不过卫生部的质评物质是不稀释的,呵呵,我们上次就是因为平时做习惯了,没有注意到稀释和不稀释结果报告是不一样的,结果报错了1．CoV=阴性对照值平均OD值×2.1。

2．阴性对照OD值大于0.05，按测得值计算。

3．阴性对照OD值低于0.05，作0.05计算。

4．OD值≥CoV者为阳性，OD值＜CoV者为阴性。放射免疫技术发光免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术

第一节概述

主要试剂:

酶标记的抗体或抗原酶标物特点：

免疫学活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性原理及特点特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析

原理及特点

酶免疫技术分类

一、按检测对象的不同一般分为两类：

1.酶免疫组织化学技术（enzymeimmunohistochemistry,EIH）:用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原或抗体。

2.酶免疫测定技术(enzymeimmunoassay,EIA):用于检测体液样本中可溶性抗原或抗体。二、根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的酶标记物，可分为：

1.均相法（homogenous）：不需要分离结合和游离的酶标记物，直接进行测定。

2.异相法(heterogenous)：需要分离结合和游离的酶标记物后才能进行测定。

酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位

液体标本中抗原或抗体的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定

酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理一、均相酶免疫测定最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供体免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫测定分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物二、非均相酶免疫测定

第二节酶标记物的制备

标记酶的要求：

活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉

一、酶和酶作用底物辣根过氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要ELISA中应用最为广泛的标记用酶常用酶酶和酶作用底物碱性磷酸酶（AP）

菌源性AP肠粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫测定

常用酶酶和酶作用底物HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种

H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高

常用底物酶和酶作用底物HRP的常见底物

邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS常用底物酶和酶作用底物OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。

HRP的常见底物

酶和酶作用底物AP的底物

β-Gal的底物

对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。常用底物酶和酶作用底物酶免疫技术的核心组成部分

酶结合物（conjugate）酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物

二、酶标记抗体或抗原的制备抗原要求纯度高，抗原性完整抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。

制备方法要求制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定，不形成聚合物制备方法过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原

戊二醛交联法戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。

纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度

常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯

第三节酶联免疫吸附试验

底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234一、基本原理固相的抗原或抗体

酶标记物（酶结合物）

酶反应的底物

三个必要试剂

二、方法类型及反应原理双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：

二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗原的方法1、已知抗体包被于载体表面3、加酶标抗体与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包被于载体表面2、加待检物无抗原与抗体结合3、加酶标抗体无抗原结合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）ELISA检测抗原的方法洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合YE间接法方法

用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用

常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定ELISA检测抗体的方法1、已知抗原吸附于载体表面2、加待检物无抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig与抗体结合4、加酶作用的底物产生颜色1、已知抗体吸附于载体表面2、加待检物有抗体与抗原结合3、加酶标的抗Ig抗体4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似应用：乙型肝炎表面抗体ELISA检测抗体的方法竞争法原理：类似检测抗原的竞争法

应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测ELISA检测抗体的方法捕获法

应用：

病原体急性感染诊断中的IgM型抗体

甲型肝炎HAV-IgM抗体

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体ELISA检测抗体的方法捕获法

原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色

洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法

固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面

三、技术要点包被技术1.固相载体要求

结合抗体或抗原的容量大抗体或抗原牢固地固定在其表面不影响免疫反应性利于反应充分进行固相方法简便易行，快速经济种类聚苯乙烯塑料磁性微球

固相载体将抗原或抗体结合于固相载体用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附包被coating封闭blocking包被与封闭抗体匹配试验确定最佳工作浓度

第四节

酶免疫印迹试验

酶免疫印迹试验（EIBT）是一种以膜为载体的酶免疫技术。以膜为固相载体将蛋白质抗原直接吸附或通过电转移方式转移至膜载体表面，形成固相抗原。加入特异性抗体或酶标记抗抗体，温育后形成免疫复合物存在于膜表面，加底物显色通过膜表面形成有色斑点或条带判定检测结果。

斑点-ELISA（dot-ELISA）实验原理与常规的ELISA相同，不同之处在于斑点-ELISA所用载体为蛋白质具有极强吸附力（近100%）的硝酸纤维素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色实验方法为：加少量（1~2μl）抗原于膜上，由于NC膜吸附能力强,故需在干燥后进行封闭；然后滴加样品血清，其中的待检抗体即与NC膜上抗原结合；洗涤后再滴加酶标二抗，最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液（如HRP标记物，常用二氨基联苯胺）；阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色斑点。斑点酶免疫试验斑点-ELISA的优点为：NC膜吸附蛋白力强，微量抗原吸附完全，故检出灵敏度可较普通ELISA高6~8倍；试剂用量教ELISA节约约10倍；操作简单，实验及结果判断不需特殊设备条件；吸附抗原（抗体）或已有结果的NC膜可长期保存（-20℃可长达半年），不影响其活性。

免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzymelinkedimmunoelectrotransferblot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southenblot相类似，亦被称为Westernblot。免疫印迹（westernblotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。

免疫印迹试验典型的印迹实验包括三个步骤：

①蛋白质的电泳分离

②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域

③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。

第五节

与生物素-亲和素系统相关的酶免疫技术

生物素(维生素H)属于维生素B类，是一种水溶性维生素，以低浓度广泛分布于所有的动、植物中，在蛋黄、酵母、牛奶及家禽的内脏中含量较高。另外，人体肠道的细菌亦能大量合成生物素，分布于全身各组织，其中在肝、肾中含量最多。

生物素(维生素H)属于维生素B类，是一种水溶性维生素，以低浓度广泛分布于所有的动、植物中，在蛋黄、酵母、牛奶及家禽的内脏中含量较高。另外，人体肠道的细菌亦能大量合成生物素，分布于全身各组织，其中在肝、肾中含量最多。

生物素（Biotin)有两个环状结构，I环为与亲和素结合的主要部位；II环为结合抗体和其它生物大分子的部位。亲和素(Avidin):亲和素是一种碱性糖蛋白，可由蛋清中提取，耐热并耐多种蛋白水解酶的作用，分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素（streptavidin）。

亲和素（Avidin)耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素结合后稳定性更好。每个亲和素能结合四个分子的生物素。BAS在应用中的基本类型有二种:一类以游离亲和素为中间物,分别连接包含生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素,称为BAB法(biotin-avidinbind,BAB);后来又在此基础上发展了亲和素-生物素化酶复合物技术(avidin-biotin-peroxidasecomplex,ABC).

另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法,或称标记亲和素·生物素法(labeledavidin-biotin,LAB)。

PAP-ABC复合法

第六节

均相酶免疫测定EMIT示意图CEDIA示意图免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，主要包括淋巴细胞、抗原提呈细胞、各种粒细胞、红细胞和肥大细胞等。

红母细胞红细胞血小板髓系干细胞粒细胞和单核细胞树突细胞

T细胞和B细胞

NK细胞和树突细胞造血干细胞的分化造血干细胞髓红系干细胞

淋巴干细胞根据各类免疫细胞独特的表面标志及其特殊功能。用体外或体内方法将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来，对其进行数量和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段,也是细胞生物学、免疫学中进行细胞分离、培养和建立细胞株等研究的重要基本技术之一。第一节免疫细胞的分离与纯化白细胞的分离外周血单个核细胞的分离淋巴细胞的纯化与亚群分离细胞活力检测白细胞的分离血中红细胞和白细胞的比例约为600～1000:1，两类细胞密度不同，其沉降速度各异，通常用以下两种方法分离。1．自然沉降法是利用血细胞自然沉降率的分离方法。采集外周静脉血，肝素抗凝，将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min后，由于红细胞沉降速率较快，可使白细胞与之分离。上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞。吸取富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。2．聚合物加速沉降法某些高分子聚合物如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等可使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。此法白细胞获得率比自然沉降法高，但其中的明胶法可使白细胞粘性增加，对实验产生一定影响。二、外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。PBMC的密度与血液中的其他成分不同。血小板的密度为1.030～1.035，粒细胞为1.092，红细胞为1.093，淋巴细胞和单核细胞的密度为1.075～1.090。利用一种密度介于1.075～1.092之间、近于等渗的溶液(分层液)进行密度梯度离心，可使不同类别的血细胞按其相应密度分布，从而被分离。常用的分层液有聚蔗糖-泛影葡胺分层液法（Ficoll-Hypaque分层液）和Percoll分层液法两种。(一)聚蔗糖-泛影葡胺分层液法聚蔗糖-泛影葡胺分层液法是分离PBMC一种单次密度梯度离心分离法。(二)Percoll密度梯度离心法Percoll分离液经高速离心后可形成一个连续的密度梯度,不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带,从而将密度不等的细胞分离纯化。二、淋巴细胞的纯化与亚群分离PBMC悬液主要含淋巴细胞，但一般还混杂有数量不等的单核细胞及少量粒细胞、红细胞和血小板。为获得高纯度的淋巴细胞或其亚群，可采用如下分离去除方法。(一)红细胞的去除一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。(二)血小板的去除将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。(三)单核细胞和粒细胞的去除1．粘附去除法单核细胞和粒细胞具有粘附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶的特性，通过PBMC与玻璃或塑料平皿的粘附作用，采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。亦可应用玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG-10柱，清除粘附的细胞，洗脱液中主要是淋巴细胞。此法简便易行，对细胞损伤极少，缺点是B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。2．羰基铁粉吞噬法单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大，再经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。也可在单核细胞悬液内加入羰基铁粉颗粒，待单核细胞充分吞噬羰基铁粉后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。(四)淋巴细胞亚群的分离淋巴细胞是复杂的不均一的细胞群体，它包括了许多形态相似而表面标志和功能各异的细胞群和亚群。根据细胞的表面标志和功能等不同，借助多种方法分离淋巴细胞亚群。1．E花环分离法成熟的T细胞表面表达绵羊红细胞(SRBC)受体，即E受体。T细胞能与SRBC结合形成E花环，而B细胞则不能。该方法简便易行，所获细胞的纯度可达95%～99%，可同时获得B细胞。缺点是E花环形成后可能使T细胞活化。E-花环T细胞B细胞花环形成细胞绵羊红细胞2．尼龙棉柱分离法将淋巴细胞悬液加入尼龙棉柱内，B细胞易粘附于尼龙棉纤维(聚酰胺纤维)表面，而T细胞则不易粘附，由此可将T细胞与B细胞分离。该法简便易行，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，所获T细胞纯度可达90%以上，B细胞纯度可达80%。3.补体细胞毒法

针对淋巴细胞CD分子的单克隆抗体与淋巴细胞相应的CD分子结合，借助补体依赖的细胞毒作用，将拟剔除的抗原阳性细胞破坏，收集未被破坏的抗原阴性细胞达到免疫细胞分离的目的。补体依赖的细胞毒试验（CDC）染料补体4．亲和板结合分离法分为直接法和间接法。直接法是用特异性抗体包被塑料平皿或细胞培养板，表达特定膜抗原的细胞即与相应抗体结合而被吸附于平皿或培养板表面，悬液中为不表达特定膜抗原的细胞。间接法是用羊(或兔)抗鼠IgG抗体(第二抗体)包被平皿，将预先与特异性单克隆抗体结合的淋巴细胞与之反应后，可发生吸附固定，从而被分离。5．免疫磁珠分离法包括直接法和间接法。直接法是将特异性抗体与磁性微粒(平均直径小于1.5μm)交联，形成免疫磁珠(IMB)。IMB与表达相应膜抗原的细胞结合，用强磁场分离磁珠结合细胞与磁珠非结合细胞，从而对特定细胞进行阳性或阴性分选。间接法是用羊(或兔)抗鼠IgG抗体(第二抗体)包被磁性微珠，可与任何已结合鼠源性单克隆抗体(第一抗体)的细胞发生反应，从而对细胞进行分离。MACS(阳性选择法）NSMACS(阴性选择法）NS6．流式细胞术分离法用流式细胞仪可自动化地对单个细胞进行多参数定量测定分析，从而可分选出用特异性荧光抗体标记的阳性细胞。其优点是分离细胞准确、快速，纯度达90%～100%，回收率高，所分离的细胞可保持无菌，细胞结构和生物学活性不受影响。缺点是费用昂贵，拟分离的细胞在混合群体中含量过低时，耗时较长才能获得所需数量细胞。五、细胞活力检测台盼蓝(trypanblue)染色法第二节淋巴细胞的数量检测不同的淋巴细胞表面具有特定的表面标志，借此可以对不同的淋巴细胞及其亚群进行鉴定和计数。T细胞表面标志及其亚群

CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcell,TrorTreg）MHC/抗原肽补体运铁蛋白TCRCD35CD28B7-2CD4CD8MHC-II/IIL-2CD71CD58（LAF-3）CD2orFcmRFcgR抗体T细胞表面受体组织胺B细胞表面标志

SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。抗原

补体(C3bi)CD23CD28B7-2CD40IL-5FcmRB细胞表面受体IL-2IgMIgECD21IL-4CD32IgG

补体(C3b,C4b)CD40-LNK细胞表面标志

人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。抗原提呈类细胞表面标志一、T细胞数量检测间接荧光免疫法酶免疫组织化学法微量细胞毒试验花环试验MHC分子四聚体法酶免疫组织化学法目前常用于鉴定T细胞和亚群的酶免疫组织化学法有ABC法和APAAP法。微量细胞毒试验

针对淋巴细胞CD分子的单克隆抗体与淋巴细胞相应的CD分子结合，借助补体依赖的细胞毒作用，可造成表达特定表面抗原的细胞损伤，破坏膜的完整性，应用伊红染料渗入细胞内，使之着染红色，而无相应CD分子的细胞则不受损伤，因而不着色。在高倍镜下计数死亡数，即可判断待检细胞是否具有相应的CD分子，从而确定T细胞及其亚群。补体依赖的细胞毒试验（CDC）染料补体花环试验

E花环试验葡萄球菌花环法花环技术抗体致敏细胞花环法E花环试验T细胞表面有特异性绵羊红细胞(SRBC)受体，即E受体。将T细胞与SRBC按一定比例混匀，置4℃至少2h或过夜，T细胞表面的E受体能与SRBC结合形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC的花环样结构（图24-5），镜检计数可得总花环(Et)形成率，亦即T细胞的百分率。部分T淋巴细胞对SRBC具有高亲和力，于室温低速短时离心后即形成花环，称为活性E(Ea)花环，它可能代表T细胞的一个亚群，Ea花环正常值仅为Et花环的1/3～1/2，约20%～40%。检测Ea花环形成细胞比Et花环形成细胞更能反映受检者的细胞免疫水平。抗原肽-MHC分子四聚体技术T二、B细胞数量检测B细胞表面有：膜表面免疫球蛋白(SmIg)、CD抗原、Fc受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红细胞受体等标志，据此可对B细胞进行数量检测。1．SmIg的检测SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞的可靠指标。大多采用荧光素或酶标记的抗人Ig抗体通过直接荧光免疫法或酶免疫组织化