生物化学电子教程

§2.7酶的作用机理及实例1.底物和酶的接近(proximity)与定向(orientation)在化学反响中，反响速度与反响物的浓度成正比，假设在酶促反响系统中的催化场所—酶的活性中心，添加底物浓度，反响速度也会随之添加。酶促反响加速的缘由之一，就是使底物分子集中于酶的活性中心，大大提高这个区域底物的有效浓度，从而加速酶促反响速度。曾测过某酶促反响中，溶液中的底物浓度为0.001mol/L,而在活性中心的底物浓度竟到达10mol/L，比溶液中高出一万倍！因此在酶活性中心区域的高底物浓度决议了高的反响速度。一.决议酶高效率催化的机制仅仅是接近还不够，还需求酶和底物的反响基团在反响中彼此相互严厉地定向，即酶活性中心的催化基团(氨基酸残基上的基团)定向于底物的反响基团。只需既接近又定向，底物分子才干迅速的构成过渡态，加速反响的进展。接近与定向A.酶的催化基团和底物的反响基团既不接近，也不定向。B.两个基团接近，但不定向，不利于反响进展。C.两个基团既接近，又定向，有利于反响进展。2.底物变形(distortion)与电子张力(electronstrain)酶与底物结合后，底物发生变形，底物由基态变为激发态，降低了活化能，使酶促反响加速。酶与底物结合后，底物发生形变。酶与底物结合后，酶分子中的某些基团或离子可以使底物敏感键中的某些基团的电子云密度添加或降低，从而产生电子张力，使敏感键的一端更加敏感，更易于发生反响。3.共价催化(covalentcatalysis)共价催化的普通方式是酶活性中心上的亲核基团对底物的亲电子基团进展攻击，二者构成共价键，这个共价中间物很容易变成过渡态，反响的活化能大大降低，反响速度加快。酶分子上的亲核基团有Ser-OH、Cys-SH、His-咪唑基等，这些富含电子的基团(有孤对电子)，攻击底物分子中电子云密度较小的亲电子基团，并供出电子，二者构成共价键，酶和底物构成一个不稳定的中间物，进而转变为产物。蛋白质中三种主要的亲核基团4.酸碱催化(acid-basecatalysis)共价催化也可以是酶的亲电基团对底物的亲核基团进展攻击，酶分子上带正电的基团有H+、Mg2+、Fe3+—NH3+等，它们攻击底物分子上带负电的亲核基团，与底物构成共价键,进展催化。酶活性中心的一些基团作为质子的供体或质子的受体对底物进展广义的酸碱催化。组氨酸的咪唑基是酶催化反响中的最有效、最活泼的催化功能基团。咪唑基的pk=6.0,在生理pH条件下，有一半以酸性方式存在，另一半以碱性方式存在，因此既可以作质子的供体又可以作质子的受体，在酶促反响中发扬作用。广义酸基团〔质子供体〕广义碱基团〔质子受体〕COOHCOO-NH3+NH2¨OHO-SHS-CCHNHN+HCHCCHNHN∶CH蛋白质中作为广义酸碱催化的功能基团5.微环境效应酶的活性中心周围的环境是一个非极性环境，即低介电环境，在低的介电环境中排斥水分子，酶的催化基团和底物分子的敏感键之间有很大的反响力，有助于加速酶促反响。假设酶的活性中心周围是一个高介电环境中，活性中心就会有水分子存在，水分子对带电离子有屏蔽作用，减弱带电离子之间的静电作用，不利于酶促反响的进展。例如：酶活性中心的羧基与水构成氢键，导致酶活性中心羧基外表有一层水化层，水分子的屏蔽作用，大大减弱了酶分子与底物离子间的静电相互引力，不利于酶促反响。二.溶菌酶〔lysozyme)溶菌酶存在于鸡蛋清和动物的眼泪中，其生物学功能是催化某些细菌细胞壁的多糖水解，从而溶解细菌的细胞壁。溶菌酶是第一个用X-射线法阐明其全部构造和功能的酶。是1922年伦敦细菌学家弗莱明(Fleming)初次发现的。1.底物、溶菌酶及酶和底物复合物的构造溶菌酶的底物溶菌酶经过水解某些细菌细胞壁的多糖组份来溶解细胞壁，细胞壁的多糖由两种糖组成:N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)N-乙酰氨基葡萄糖乳酸(NAM)溶菌酶的最适小分子底物NAG和NAM交替陈列构成多聚物，它们之间经过β-1,4糖苷键相连。溶菌酶的最适小分子底物为NAG-NAM交替构成的六糖。6个糖环分别用A、B、C、D、E、F表示。溶菌酶水解D糖环和E糖环之间的糖苷键。溶菌酶的构造

溶菌酶由129个氨基酸残基构成，是一个单链蛋白，分子内含有四对二硫键。活性中心的氨基酸残基是Glu35和Asp52。鸡蛋蛋清溶菌酶的氨基酸序列溶菌酶和底物结合的空间构象从外表构象看，酶的构造不很严密，大多数极性氨基酸残基分布在分子的外表，非极性氨基酸残基分布在分子的内部。整个酶分子中有一狭长的凹穴。最适底物正好与酶分子的凹穴相结合，凹穴中的Glu35和Asp52是活性中心的氨基酸残基。溶菌酶----底物复合物2.催化作用机理溶菌酶底物与酶活性中心的关系溶菌酶活性中心上的Asp52氧原子间隔底物敏感键(C-O键)中碳原子〔D糖环氧原子〕只需0.3nm，活性中心上另一个氨基酸Glu35的羧基间隔底物敏感键(C-O键)中氧原子也只需0.3nm，溶菌酶的活性中心的氨基酸残基与底物敏感键既接近又定向。底物D糖环构象发生变化溶菌酶底物D糖环变形模型图椅式：C5、C1、C2和O不在同一平面C5向前挪动，O原子向后挪动半椅式：C5、C1、C2和O在同一平面上酶与底物结合后，D糖环构象发生变形，从正常的能量较低的椅式构象变为能量较高的半椅式构象。酸碱催化酶活性中心的Glu35处于非极性区，其羧基呈不解离形状，而Asp52处于极性区，羧基呈解离形状。Glu35COC1C4HOEOH(NAG)NAGOOHOCO-Asp

52Asp

52-COOONAGDHOEOHC4C1OCGlu

35-HOH-+H2O+H非极性区极性区(NAG)O33Glu35的羧基起广义酸碱催化，向底物D糖环和E糖环之间的糖苷键上的氧原子提供一个质子，氧原子与D糖环C1的糖苷键断开，D糖环的C1带上正电荷成为正碳离子。Asp52上的-COO-起着协调糖苷键断裂和稳定正碳离子的作用。DGlu35COOHOC1HOHD(NAG)3OCO-Asp

52最后，来自环境中的水分子上的H+与Glu35的-COO-结合，水分子上的HO-与正碳离子结合，至此，一次反响完成，细胞壁翻开一个缺口。经多次反复作用，细菌的细胞壁溶解。3.溶菌酶催化特点小结接近与定向底物形变酸碱催化〔二〕胰凝乳蛋白酶〔chymotrypsin)胰凝乳蛋白酶是由241个氨基酸组成，分子量为25000，分子呈椭圆状，含α-螺旋较少。活性部位由Ser195、His57、Asp102三个氨基酸残基构成，这三个氨基酸残基构成催化三联体。催化三联体：催化机理：酶活性中心的三个氨基酸底物His57作为质子的受体从Ser195汲取一个质子，构成共价键，使Ser195-O-成为很强的亲核试剂，攻击底物羰基碳原子，二者构成共价键。电子云向底物羰基氧原子转移第一步第二步底物-NH上的电子云向酶分子的His57-N+H转移，His57作为酸向底物提供质子。底物的C-N键断裂第三步底物C-N键氮端产物释放第四步第五步水分子的-OH亲核攻击底物羰基碳原子,构成共价键。His57作为质子的受体从水分子上接受质子。第六步底物C-O-的电子云向His57-N+H转移,Ser195的氧与底物的碳之间的共价键断开。Ser195作为质子的受体从His57接受质子，酶恢复原状。第七步第八步胰凝乳蛋白酶催化机制的特点：广义的酸碱催化共价催化丝氨酸蛋白酶〔serineproteases〕丝氨酸蛋白酶是一类最有特征的酶家族，它包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、枯草杆菌蛋白酶等。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶为消化酶，在胰腺中合成，以非活性的酶原方式分泌到消化道，在消化道中转化成有活性的酶。这三种酶在一级构造上有40%的氨基酸顺序是一样的，三维构造也很类似，都有Ser195、His57、Asp102三个氨基酸残基构成的催化三联体，它们的催化作用机理也类似，但它们的专注性是完全不同的。这三种酶的活性部位位于分子外表的凹陷区域，这个凹陷构造区域称为口袋。由于三种蛋白酶的口袋的差别呵斥它们的专注性不同。胰凝乳蛋白酶的口袋底部有一个小的Ser，口袋上方有两个小的Gly残基，有利于较大的芳香族氨基酸侧链进入，因此胰凝乳蛋白酶催化芳香族氨基酸构成的肽键。胰蛋白酶口袋底部有一个带负电荷的Asp，有利于结合带正电荷的Arg、Lys残基，决议了胰蛋白酶可以催化精氨酸和赖氨酸羧基构成的肽键。弹性蛋白酶有一个浅的口袋，口袋上方有大的Thr和Val残基，只允许小分子的氨基酸像甘氨酸、丙氨酸进入，因此弹性蛋白酶可催化甘氨酸和丙氨酸羧基构成的肽键。§2.8酶原激活有些酶在体内合成出来即可自发的折叠成一定的三级构造，酶就立刻表现出酶活性，如溶菌酶。有些酶在体内合成出来的只是它的无活性的前体，经过蛋白酶的催化作用，构象发生变化，才干变成有活性的酶。该活化过程，是生物体内的一种调控机制。这种调控机制的特点：由无活性的酶原转变成有活性的酶是不可逆转的。一.胰蛋白酶原的激活二.胰凝乳蛋白酶原的激活三、几种蛋白酶的激活及它们之间的相互作用弹性蛋白酶胰蛋白酶原六肽＋胰蛋白酶本身催化肠激酶羧肽酶原羧肽酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶原§2.7寡聚酶、同功酶、诱导酶、固定化酶一、寡聚酶寡聚酶是由两个或多个亚基组成的酶。二、同功酶同功酶是指能催化同一化学反响，但其酶蛋白本身的分子构造组成都有所不同的一组酶，它们的Km和Vm各不一样。如：哺乳动物中有五中乳酸脱氢酶，它们催化同一反响，分子量相近，但氨基酸组成及顺序不同，可用电泳法得到。三、诱导酶根据诱导酶合成与代谢物的关系。人们把酶相对地域分为构造酶和诱导酶。构造酶是指细胞内天然存在的酶，它的含量稳定，受外界的影响小。诱导酶是指当细胞中参与特定诱导物后诱导产生的酶。它的含量在诱导物存在下显著增高。这种诱导物往往是该酶底物的类似物或底物本身。诱导酶或许是细胞中本身就存在，但含量低，当参与诱导物后显著增高；或许是细胞中不存在这种酶，当参与诱导物后诱导产生。四、固定化