透射电子显微镜1

透射电子显微镜〔TransmissionElectronMicroscopeTEM〕

TEM具有和光镜类似的构造系统,由电子枪产生的电子射线作为光源,由电磁透镜替代光镜中用玻璃制成的聚光镜、物镜和目镜

TEM镜体构造相当复杂，镜筒内部要求高真空形状

第一节透射电镜构造和任务原理

一、透射电镜构造二、透射电镜任务原理★第二节透射电镜样品制备技术

一、超薄切片技术★二、特殊组织样品制备第一节透射电镜的构造和任务原理照明系统：电子枪、会聚透镜镜筒{成像系统：样品室、物镜、中间镜、投影镜察看记录系统：察看室、底片室真空系统：机械泵、油分散泵、真空管等辅助{电源系统：高压电源、透镜电源、调压器等水冷系统：循环水泵等一、透射电镜的根本构造

〔一〕电子束与电磁透镜

＆电子束在真空中运动的速度与加速电压有关〔阳极〕加速电压越高，电子束的波长越短(根据光学阿贝公式原理，一台仪器的成像最高分辨率，约为它运用信息传送媒介波长的一半。电镜之所以能获得很高的成像分辨率，是由于它的电子束波长久较可见光的波长为短〕＆电磁透镜的焦距与磁场〔线圈组成，当电流经过时产生磁场〕强度有关,磁场越强，焦距越短，放大倍率越高二、透射电镜的任务原理〔二〕电镜图像构成任何物质都是由原子组成的，当均匀的电子束穿过样品时会遭到样品上信息的处置多数电子可从原子和原子之间的空隙穿过，极少部分电子与原子核和轨道电子发生碰撞而构成散射电子散射电子才干强的地方透过电子数目少打在荧光屏上所发出的光弱，显现为暗区

散射电子才干弱的地方透过电子数目多打在荧光屏上所发出的光强显现为亮区样品构造不同散射电子的才干不同，结果？第二节透射电镜样品制备技术

一、常规样品制备技术

超薄切片技术※负染技术

二、特殊样品制备技术

电镜酶细胞化学技术免疫电镜技术电镜原位杂交技术等

普通光镜切片厚度约5µm左右—石蜡切片透射电镜切片厚度在50nm左右—超薄切片〔100nm以下〕

目前有关生物体的各种组织、细胞的形状结构知识大部分是超薄切片技术所提供一、超薄切片制备技术取材预固定后固定脱水浸透包埋修块切片染色

超薄切片技术的根本操作程序

快尽量坚持其生活形状，在1分钟内固定

小1mm³的小块

轻不要牵拉、锯、挤压组织

冷4℃保管

〔一〕取材

1、固定目的把在活体形状时的构造尽能够完好保管下来2、常用固定剂⑴戊二醛〔glutaraldehyde〕对糖原、糖蛋白、尤其是微管、内质网细胞基质有较好的固定作用

⑵四氧化锇(osmiumtetroxide,OSO4)对含蛋白质、脂肪性物质有良好的固定作用特别对磷脂蛋白膜的构造有良好的保管作用

〔二〕固定⑶高锰酸钾(potassiumpermangauate)

对磷脂蛋白类有特别良好的固定作用

尤其对神经髓脂质的维护更为显著⑷甲醛〔formaldehyde〕

对酶活性的保管却优于戊二醛

在电镜细胞化学中常采用3固定方式

⑴组织块浸泡固定取数块1mm³的组织块迅速浸泡于固定液中

⑵体内原位固定适用于动物实验，将动物麻醉解剖，暴露所需的组织或器官，立刻用预冷的戊二醛滴到上面直到组织适度变硬，再取数块组织固定

⑶灌流固定多用于脑、肾赃、视网膜和睾丸等组织将固定液经血液循环灌流到动物体内,把活细胞在原位及时固定

指将样品内所含的游离水分完全去除的过程(常用的脱水剂为乙醇和丙酮)50%乙醇10～15分钟4℃70%乙醇10～15分钟4℃80%乙醇10～15分钟4℃

90%乙醇10～15分钟4℃

100%乙醇3次，每次10分钟，室温〔三〕脱水

经脱水处置的样品，即可用包埋剂进展浸透

浸透利用包埋剂逐渐取代样品中的脱水剂使细胞内外一切空隙都被包埋剂填充包埋浸透好的样品块放入灌满包埋剂的胶囊或适当的模具中经过紫外线照射或加温聚合，即可制成包埋块包埋剂环氧树脂618、Epon812LowiscrylK4M低温树酯包埋剂〔四〕浸透与包埋〔半薄切片的意义：1、选取超薄切片的部位超薄切片的面积普通要小于0.5mm2，要经过半薄切片选取有意义的部位〔对肾脏、胰腺、脑、肌组织等更重要〕2、对同一部位进展光、电镜对比察看经过半薄切片可以在较大范围内了解组织构造、病变部位和病理性质，有利于更确切的认识超薄切片中的构造及其相互关系。五、半薄切片热膨胀推进式切片机利用金属杆加热产生的

微小长度变化提供进给

机械推进式切片机用微动螺旋和微动杠杆

来提供微小进给超薄切片机(Ultrotome)六、超薄切片◆安装包埋块、安装玻璃刀、调整包埋块和刀的间隔、调理水槽高度与灯光的位置、调理水槽液面、选择切片速度及进给厚度、片子切出后，漂浮在水槽的液面上，经展片后捞到载网上

◆判别切片厚度：普通利用切片外表反射的光和从切片下面反射光发生干涉所产生的干涉色为根据不同厚度的切片在显微镜下呈现不同的干涉色灰色40-50nm银灰色50-70nm金黄色70-90nm紫色90nm以上切片操作

电镜图像反差是由于电子束经过样品时电子散射程度不同产生的

散射的电子数越多，图像越？散射的电子数越少，图像越？◆重金属化合物有较强的电子散射才干,所以经过重金属染色的样品呈现较强反差

七、电子染色常用的染色剂有醋酸铀和枸橼酸铅◆醋酸铀〔Uranylacetate〕能与细胞内多种成分结合，尤其对核酸核蛋白等有较强的结合才干◆枸橼酸铅(leadcitrate)能提高细胞膜系统及其脂类的反差

(一)骨组织样品制备方法〔二〕培育细胞样品制备方法〔三〕血细胞样品制备方法〔四〕石蜡包埋样品转制方法二、几种特殊组织的样品制备方法

1.将新颖骨组织锯成2—3mm厚的骨片，立刻投入固定液中24小时〔4℃〕。

2.漂洗后投入脱钙液中在室温或4℃下进展脱钙〔正常密质骨脱钙时间普通为3-4周，松质骨为7-10天，4℃脱钙时间应适当延伸〕3.脱钙后再将样品修成1mm3大小，然后充分浸泡，再按常规方法进入后固定、脱水、浸透包埋、半薄、超薄切片和电子染色。(一)骨组织样品制备方法脱钙液配制乙二胺四乙酸二钠40-50g双蒸馏水500ml0.2mol/LNaOH350ml双蒸馏水加至1000ml1、将培育瓶内的培育液倒掉，参与预冷的2.5%戊二醛固定2、用橡皮刮子将全部细胞从管壁上悄然刮下，搜集在离心管内离心〔2000转/分〕15-20分钟3、弃上清，将沉淀的细胞团块取出，用棉花纸包裹起来，然后进展漂洗等后面的程序二、培育细胞样品制备方法

负染色技术主要用于细菌、病毒、噬菌体等微生物大分子构造、亚细胞碎片以及分别的细胞器等研讨任务又称阴性染色，指经过重金属盐在样品周围的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负反差，烘托出样品的形状和大小三、负染色技术((Negative〕

当把有些重金属的盐溶液与生物资料的悬浮液混合以后，重金属的盐类不是被样品成分所吸收，而是沉淀到样品周围假设样品具有高低不平外表构造，染液还能穿透进外表的凹陷部分。这样在重金属元素沉淀的地方，散射电子的才干加强，因此样品周围表现为暗区，而在有样品的地方散射电子才干弱，因此表现为亮区。这样便能把样品的外形与外表构造清楚地烘托出来目前，对其染色原理还不非常清楚，有密度反差原理和异常反差原理二种观念。〔一〕负染技术的原理1.染色液目前最常用的为磷钨酸〔Phosohotungstate〕配制成2-4%磷钨酸水溶液磷钨酸的密度约为4，而生物标本的密度为1外周染料密度与标本密度相差4倍直径很小的物体可被明晰地显现出来

2.染色方法负染色所用的样品全部取自悬浮液将带有样品的悬液，滴于有支持膜的铜网上，静止数分钟后滴上染液数秒钟到2分钟，随后进展电镜察看〔二〕负染样品的制备

第三章重点

电子枪发射电子经会聚透镜会聚成电子束投射在样品上，电子直接穿透样品产生透射电子，透射电子带有样品信息，经成像系统放大投射到察看室的荧光屏上，荧光屏将电子影象转化为可见光影象以供运用者察看透过的电子多荧光屏亮，反之荧光屏暗，荧光屏的亮、暗程度与样品微细构造一一对应，最终产生具有一定反差的黑白影像一、透射电镜任务原理LMTEM照明源光线电子分辨率0.2µm0.1nm放大1000×150万×透镜玻璃磁透镜应用显微程度