超高效液相色谱-串联质谱法同时测定染发剂中6种染料

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定染发剂中6种染料游飞明【摘要】建立了同时测定染发剂中4,4-二氨基二苯胺硫酸盐和2,4-二氨基苯酚硫酸盐等6种染料的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析方法。以水为提取剂进行超声提取，用WatersBEH-C18柱(100mmx2.1mm,1.7pm)分离，以10mmol/L的乙酸铵和乙腈为流动相进行梯度洗脱。在电喷雾正离子模式下，采用多反应监测(MRM)模式进行定性和定量分析。6种染料在相应的质量浓度范围内线性关系良好,线性相关系数(R2)均大于0.99,检出限为0.26~4.6mg/kg,回收率为83.0%~92.2%,相对标准偏差为5.4%~11.2％。方法精密度、准确度、回收率和基质效应均符合染发剂样品测定的要求,用于实际样品测定,结果满意。本方法准确、简便、快速,适用于染发剂中6种染料的分析测定。％Asensitivemethodwasdevelopedforthesimultaneousdeterminationofsixcompo-nentswhichincluded4,4'-diaminodiphenylaminesulfatehydrateand2,4-diaminophenolsul-fate,etc.inhairdyesbyultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry(UPLC-MS/MS).Afterextractedbywaterthroughultrasonicextraction,thesampleswereana-lyzedbyUPLC-MS/MS.TheseparationwasperformedonaWatersBEH-C18column(100mmx2.1mm,1.7pm)withgradientelutionof10mmol/Lammoniumacetateandacetonitrile.Theelectrosprayionization(ESI)sourceinpositiveionmodewasusedfortheanalysisofthesixcomponentsinthemultiplereactionmonitoring(MRM)mode.Theresultsshowedgoodlinearrelationshipswithallthecorrelationcoefficients(R2)morethan0.99.Thelimitsofdetection(LODs,S/N=3)forthesixcomponentswereintherangeof0.26-4.6mg/kg.Theaveragerecoveriesofthesixcomponentsinthespikedsampleswereintherangeof83.0%-92.2%withtherelativestandarddeviations(RSDs,n=6)of5.4%-11.2%.Theprecision,accuracy,meanrecoveriesandthematrixeffectssatisfiedtherequirementsofcosmeticsamplemeasurement.Theproposedmethodhasbeenappliedtothedeterminationofsixdyesinactualsamples.Thismethodissimple,accurateandeffectiveforthesimultaneousdeterminationofthesixcompo-nentsinhairdyes.【期刊名称】《色谱》年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P17-21)【关键词】超高效液相色谱-串联质谱;染料;染发剂【作者】游飞明【作者单位】国家加工食品质量监督检验中心，福建省产品质量检验研究院，福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】O658目前人们使用的染发剂依据染发效果可分为3类:暂时性、半永久性和永久性[1]永久性染发剂又可以分为植物永久性、金属永久性和氧化永久性；前两者的染料分别提取于植物和矿物质，植物性染发剂价格贵［2］，国内少用，而金属性染发剂对人体伤害极大［3］，现已几乎不用。氧化永久性染发剂是目前市场上最流行的一类染发剂［4］，含有染料中间体和偶合剂，这些染料中间体和偶合剂渗透进入头发的皮质后，发生氧化反应、偶合和缩合反应形成较大的染料分子，被封闭在头发纤维内，所以难以从头发纤维孔径中洗脱出来。染料中间体多是苯胺类等成分，特别是对苯二胺及其衍生物等有毒物质，染发时就易通过发髓、皮肤或呼吸等多种方式被人体吸收，其一旦进入人体内便很难排出，容易蓄积中毒，而且具有诱导基因突变致癌作用和极易引发皮肤过敏反应［5］。基于染发剂的安全问题，各国都出台了相关法规（如欧盟化妆品法规（EC）No1223/2009，美国FDA的联邦法例第21章以及加拿大的食品和药物法令中的化妆品条例等）限制其有害物质的含量，并推荐了相关有害物质的检测方法。我国《化妆品卫生规范》（2007年版）［6］中规定了93种暂时允许使用的染料成分，且对其最大允许使用浓度、其他限制和要求等做了严格的规定，但现有的国家标准法规对允许使用染料成分的检测覆盖率还不及60%，远不能满足染发剂分析的需要。目前报道的染发剂中染料的检测技术有很多，主要包括高效液相色谱法［7，8］、液相色谱-质谱联用法［9］、气相色谱法［10］、气相色谱-质谱联用法［11，12］、离子色谱法［13］和毛细管电泳法［14］。由于本文研究的6种染料物质极性强、不易挥发、不稳定等性质，相比气相色谱或气相色谱-质谱联用法，高效液相色谱和液相色谱-质谱联用法更适合用于检测，目前应用最多的是液相色谱-质谱联用法［15-17］。本文建立了同时测定染发剂中6种染料的超高效液相色谱-串联质谱方法，采用电喷雾离子（ESI）源，在正离子和多反应监测（MRM）模式下进行定性定量分析。该方法前处理简单，易于操作，灵敏度高，可有效满足对4,4'-二氨基二苯胺硫酸盐和2,4-二氨基苯酚硫酸盐等6种染发剂染料进行快速检测工作的需要。实验部分仪器与试剂超高效液相色谱仪WatersACQUITYUPLC系统配QuattroPremierXE串联四极杆质谱仪（美国沃特世公司）；Milli-Q超纯水纯化系统（美国Millipore公司）；涡旋混合器（江苏健康医药公司）；高速冷冻离心机（美国贝克曼公司，AvantiJ-E）；超声波清洗器（上海生析超声仪器有限公司）；分析天平（赛多力斯（北京）科学有限公司，感量为0.1mg）。6种标准品:4，5-二氨基-1-（2-羟乙基）吡唑硫酸盐（4，5-diamino-1-（2-hydroxyethyl）pyrazolesulfate，DHPS），2-（2-羟基）乙基对苯二胺硫酸盐（2-（2-hydroxy）ethyl-p-phenylenediaminosulfate，HEPS）,4,4'-二氨基二苯胺硫酸盐（4,4'-diaminodiphenylaminesulfatehydrate,DSH）,羟乙基-3,4-亚甲二氧基苯胺盐酸盐（N-（2-hydroxyethyl）-3,4-methylenedioxyanilinehydrochloride,HMH）,2-氯-p-苯二胺硫酸盐（2-chloro-p-phenylenediaminesulfate,CPS）及2,4-二氨基苯酚硫酸盐（2,4-diaminophenolsulfate,DPS），纯度均＞95.0%,购自上海安谱公司。乙酸铵（优级纯,上海生工生物工程有限公司）；乙腈（色谱纯,山东禹王实业有限公司化工分公司）；水为Milli-Q超纯水。空白基质溶液为不含6种目标分析物的染发膏样品提取液。标准溶液配制准确称取适量上述标准品，分别置于25mL棕色容量瓶中，用水溶解，配制质量浓度约为500mg/L的单标准储备液。用移液器移取各单标储备液适量至50mL容量瓶中,配成质量浓度约为100mg／L的混合标准中间液,分别移取标准中间液适量,用空白基质提取液稀释至所需浓度,配成基质加标混合标准使用溶液。所有标准溶液均在4°C下保存，当天使用。样品制备准确称取试样0.5g(精确至0.1mg)于50mL具塞比色管内，加入40mL水，涡旋混匀1min后，超声提取15min，用水定容至50mL，混匀，以10000r/min速度离心5min，取上清液过0.2pm聚四氟乙烯(PTEF)滤膜，用UPLC-MS／MS检测。色谱和质谱条件色谱条件色谱柱:WatersACQUITYUPLCBEH-C18(100mmx2.1mm,1.7pm)。流动相:A为10mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈。流速:0.3mL/min。柱温:35°C。进样体积:5pL。梯度洗脱程序:0~0.5min,96%A;0.5~4.5min,96%A~70%A;4.5~5.0min,70%A;5.0~5.1min,70%A~10%A;-6.0min,10%A;6.0~8.0min,96%A。质谱条件离子源:电喷雾正离子模式。采集方式:MRM模式。毛细管电压:1.00kV。离子源温度：120°C。脱溶剂气温度：400C。脱溶剂气流量：700L/h。锥孔反吹气流量：50L/h。碰撞室压力:0.27Pa。其他实验参数见表1。表16种染料的UPLC-MS/MS参数和保留时间Table1UPLC-MS/MSparametersandretentiontimesofthesixdyes*Quantitativeion.AnalyteRetentiontime/minIonpairs(m/z)Conevoltage/VCollisionenergies/eVDHPS0.93143.1/99.1*;143.1/126.12512;12DPS1.12123.0/95.1*;123.0/78.13015;25HEPS1.35153.0/135.0*;153.0/118.02010;20CPS3.04143.0/108.0*;143.0/80.03015;25DSH3.76199.3/106.1*;199.3/182.24025;25HMH4.32182.0/137*;182.0/106.02520;15结果与讨论色谱柱的选择实验中对WatersACQUITYUPLCBEH-C18柱(100mmx2.1mm,1.7pm)、PhenomenexKinetex苯基柱(50mmx3.0mm,2.6pm)以及资生堂CapcellpakST柱(150mmx2.0mm,5pm)3种色谱柱的分离效果进行了比较。结果表明，苯基柱虽然能明显增加DPS的检测灵敏度，但对其他5个组分灵敏度较低；资生堂CapcellpakST柱为亲水作用色谱柱，适合极性较大物质的分离，实验发现在该柱上DSH、HMH和DPS均无法正常出峰；而BEHC18柱对6种染料的分离效果和峰形均较令人满意，因此选择此柱作为分离柱。流动相的选择比较了水-乙腈、10mmol/L乙酸铵-乙腈和0.01%(v/v)甲酸-乙腈流动相体系下6种染料的分离效果。结果表明，水-乙腈体系中6种染料的峰形较宽，0.01%(v/v)甲酸-乙腈体系会造成DSH检测灵敏度的大幅下降，而10mmol/L乙酸铵-乙腈体系对6种染料均有较好的峰形和灵敏度。质谱条件的优化配制5mg/L的6种染料单标准溶液，由注射泵直接进质谱检测，进行一级质谱全扫描，发现在ESI(+)模式下，6种染料均有较好的响应。优化毛细管电压、锥孔电压和干燥气温度、干燥气和辅助气流速，使母离子的响应最大，然后再对母离子进行子离子扫描，调节各染料的碰撞电压等参数。经过优化后最终确定各染料的定量和定性子离子及相应的质谱参数(见表1)。在优化条件下6种染料的定量离子监测图和总离子流色谱图(TIC)见图1。图16种染料在BEH-C18柱上的定量离子监测谱图和总离子流色谱图Fig.1Quantitativeionchromatogramsandtotalionchromatogram(TIC)ofthesixdyesonBEH-C18column提取溶剂的选择6种染料均易溶于水中，在有机溶剂中溶解度较小，因此本实验选择水相作为提取溶剂，并比较了水、10mmol/L乙酸铵溶液和0.03%(v/v)甲酸溶液的提取效果。结果表明，这3种提取剂对6种染料的提取效果有很大差别，0.03%(v／v)甲酸溶液作为提取剂时DPS、HEPS及CPS峰展宽严重；10mmol/L乙酸铵溶液会大大降低HEPS的提取率；而用水作为提取溶剂时色谱峰峰形良好，且具有良好的回收率，因此本实验选用水作为提取溶液。线性关系、检出限和定量限以空白基质溶液作为标准溶液的稀释液，精确配制一系列浓度的混合标准工作溶液，在优化的色谱-质谱条件下进行测定。分别以各分析物的峰面积(Y)和对应的质量浓度(X,mg/L)进行线性回归计算，得到线性回归方程和线性相关系数(R2),以定量离子色谱峰的S/N二3时的浓度确定方法的检出限，以S/N二10时的浓度确定方法的定量限，结果如表2所示。结果表明，6种染料在相应的质量浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.99，检出限为0.26~mg/kg,定量限为0.86~16mg/kg,说明本方法完全能够满足国家卫生标准[6]中对这6种染料使用量不大于最大许可含量(MPC)的检测要求。表26种染料的线性范围、线性方程、相关系数、检出限、定量限与最大许可含量Table2Linearranges,linearequations,correlationcoefficients(R2),limitsofdetection(LODs),limitsofquantification(LOQs)andthemaximumpermissiblecontents(MPC)ofthesixdyesY:peakarea；X:massconcentration,mg/L.AnalyteLinearrange/(mg/L)LinearequationR2LOD/(mg/kg)LOQ/(mg/kg)MPC/%[6]DHPS0.0250-6.25Y二185875.0X+2287.90.99590.421.42.25DPS0.362-90.5Y二127202.0X+8591.20.99233.81310.0HEPS0.0752-18.8Y二204400.0X+12894.90.99240.260.863.0CPS0.00752-18.8Y二15127.8X+2664.70.99441.23.71.0DSH0.262-65.5Y二607745.0X+2837.60.99014.6166.0HMH0.125-31.2Y二34629.5X+4904.10.99420.270.903.0方法的精密度和回收率以不含6种目标分析物的染发膏样品作为空白样品，分别添加高、中、低3个水平的混合标准溶液，进行回收率和精密度试验，每个浓度水平平行测定6次，结果如表3所示。在3个浓度水平下，各待测物的平均回收率为83.0%~92.2%,相对标准偏差为5.4%~11.2%，能满足实际样品的分析测定要求。表36种染料在3个加标水平下的回收率和精密度（n二6）Table3Recoveriesandprecisionsofthesixdyesatthreespikedlevels（n=6）AnalyteSpiked／（mg／L）Found／（mg／L）Recovery／%RSD／%DHPS0.100.08686.011.20.500.4488.08.22.502.2489.67.9DPS1.000.8383.010.95.004.3587.07.625.0022.2088.86.6HEPS0.100.08484.09.70.500.4386.08.32.502.2590.06.9CPS0.200.1785.08.61.000.8787.06.45.004.5691.25.6DSH1.000.8888.07.25.004.5290.45.425.0023.0592.26.7HMH0.100.8585.08.30.500.4386.05.82.502.2891.26.1实际样品的测定采用该方法对市场上20份不同品牌的染发剂中6种染料的含量进行测定，共有6个样品检出4种染料成分；6种染料除了DPS和HMH在样品中未检出，其他4种染料成分在6个阳性样品中有不同程度的检出，结果见表4。表4阳性染发剂样品中6种染料的含量Table4Contentsofthesixdyesinpositivehairdyesamplesg／kgND:notdetected.SampleDHPSDPSHEPSCPSDSHHMHS1NDNDNDND0.27NDS2NDNDND3.0NDNDS3NDNDND0.70NDNDS4NDNDNDND1.2NDS5NDNDND1.2NDNDS63.0ND0.56NDNDND结论本文建立了UPLC-MS/MS同时测定染发剂中4,4-二氨基二苯胺硫酸盐和2,4-二氨基苯酚硫酸盐等6种染料的分析方法。本方法检测速度快，灵敏度高，选择性好，回收率较高，完全能够满足国家卫生标准中对这6种染料使用量不大于1.0%~10%的检测要求。本方法的建立是对现有的染发剂中染料检测方法的有效补充，为染发剂中染料的检测提供了一种快速、简单、准确的检测技术。参考文献：[1]ZhouM.Detergent&Cosmetics（周盟.日用化学品科学），2008,31（9）:6[2]TongY.ChemicalIndustryTimes（仝毅.化工时刊），1999（5）:4[3]ZhaoX，WangY.GuangzhouChemicalIndustry（赵鑫，汪原.广州化工），2013，41（5）:15[4]ZhuHJ,YangYW,ZhuY.JournalofEnvironmentandHealth（朱会卷，杨艳伟，朱英.环境与健康杂志），2010，27（6）:513XiaoZY.ChinaCosmeticsReview（肖子英.中国化妆品），2007（9）:90MinistryofHealthofChina.HygienicStandardforCosmetics.Beijing:MinistryofHealthofPeople'sRepublicofChina（卫生部.化妆品卫生规范.北京:中华人民共和国卫生部），2007ChenX，ZhangGW.JournalofNanchangUniversity:NaturalScience（陈希，张国文.南昌大学学报:理科版），2014，38（2）:143QianX，JinRN，ZhaoL，etal.