DB22T 3601-2023 人参锈腐病菌分子检测 实时荧光定量PCR法

ICS65.020.20CCSICS65.020.20CCSB16吉 林 省 地 方 标 准DB22/T3601—2023法DetectionofIlyonectriarobustacausingginsengrustyrootrotbyquantitativereal-timePCR2023-12-28发布 2024-02-01实施吉林省场监理厅 发布DB22/T3601—2023DB22/T3601—2023II前 言本文按照GB/T1.1—2020《准工导则 第1分标化件构和草则的规定草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：吉林农业大学、吉林参王植保科技有限公司。本文件主要起草人：陈长卿、姜云、高洁、徐怀友、卢宝慧、杨丽娜、姜伊琳。DB22/T3601—2023DB22/T3601—2023PAGEPAGE1人参锈腐病菌分子检测实时荧光定量PCR法范围PCRPCR检测原本文件适用于人参根和土壤中锈腐病菌的实时荧光定量PCR分子检测。（GB/T6682 GB/T28067 RT-PCRGB/T28067界定的以及下列术语和定义适用于本文件。人参腐病 ginsengrustyrootrot一种主要由强壮土赤壳菌（Ilyonectriarobusta）侵染人参根部导致的土传病害。实时光量PCR法 quantitativereal-timePCR一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测定每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。Ct值 cyclethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。[来源：GB/T28067—2011，2.3]原理I.robustaHistone进行PCRPCRPCR光信号值。随着PCR扩增反应的进行，CtCt值判断除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。试剂水，GB/T6682DNADNAPCR引物′-CGCCACCGACCTACCTCCCC-5′ATGTGTTGAGCGAGCGTA引物用水稀释成10μmol/L，-20℃保存备用。0.001g。PCR/350nm～750（SYBRGreen3.0℃/s0.50.34℃～100℃。：125kPa。12000rpm冰箱：4℃，-20℃，-800.1μL～2.5μL，2μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。样品人参锈腐病强壮土赤壳菌菌丝体DNA。3DNA。3DNA。无菌一级水。人参采集新鲜人参根，装入密封袋，置于冰盒中，在实验室用研磨机将参根打碎，充分混合，4℃保存不超过12h，也可-80℃长期保存。土壤每25m2人参田块采用梅花形采样法，不少于5点，每个点取人参根际土壤样品50g，装入密封袋，充分混合，置于冰盒中，4℃保存不超过12h，也可-80℃长期保存。DNADNADNADNADNA浓度为100ng/μL～200比值为1.8～2.0之间时，DNA模板适宜荧光定量PCR扩增。用无菌一级水将模板DNA浓度稀释成50ng/μL用于荧光定量PCR扩增。PCR反应体系见表1。表1 实时光量PCR反系试剂体积（μL）2×SYBRGreenMix10.0正向引物（10μmol/L）0.2反向引物（10μmol/L）0.2DNA模板1.0二甲基亚砜DMSO1.0一级水7.6总体积20.0按照商品化试剂盒说明书进行荧光定量PCR反应，每个样品重复3次。15PCR在PCR反应体系正常工