一种新型猪瘟病毒装甲RNA质控品有助于提高猪瘟疫病临床检测的准确性

摘要[目的]研制一种安全稳定高效的猪瘟核酸检测质控品，为猪瘟疫病监测提供技术支持。[方法]将猪瘟病毒核酸检测靶基因构入至新型装甲RNA表达载体pTMACC，转化、表达并纯化，制备猪瘟病毒装甲RNA质控品。借助电泳、电镜、动态散射分析鉴定该物质结构特性，并对其均匀性、稳定性进行分析，评估其实用性能。[结果]该装甲RNA颗粒含有猪瘟病毒特异性基因，序列溯源至法国Thiverval株；为RNA-蛋白复合物，颗粒呈直径约26nm的多边形；该质控品均匀、稳定，-20℃至少稳定保存36个月；经8家权威实验室性能评估，该物质可以作为猪瘟病毒核酸检测质控品。[结论]猪瘟病毒装甲RNA质控品均匀性良好，稳定性强，无生物传染性，核酸RNA不易降解，可稳定保存，进一步保障猪瘟疫病的临床检测的准确性。1背景猪瘟(classicalswinefever，CSF)是一种由经典的猪瘟病毒（CSFV）引起的高度接触性、传染性疾病，为我国二类动物传染病，同时也是OIE必报疫病。该病的高发病率和高死亡率给全球范围内的养猪业造成巨大经济损失，严重危害畜牧业的发展。目前，国内猪瘟疫情的主要特点为温和性、散发性、多种病原混合感染、隐性感染和亚病毒感染等，非典型猪瘟病理变化的情况时有发生，这对CSF的临床诊断带来了很大的困难。目前，国内外许多研究者建立了猪瘟病毒分子生物学诊断方法。但是，由于缺乏安全稳定的阳性质控品，使得猪瘟核酸检测方法很难做到全程监控。利用AmoredRNA技术制备的装甲RNA颗粒稳定、易保存、安全性高，能模拟天然病毒结构特性，与临床样本保持一致，可作为核酸提取、扩增和扩增后分析等各个环节的质控，确保结果的真实可靠，可有效克服传统RNA物质存在的缺陷。本研究采用一种新型装甲RNA表达载体，将猪瘟检测靶基因构入其载体，制备的装甲RNA颗粒能够代替真病毒或质粒等物质，用于该病核酸检测的质控，为猪瘟疫病监测提供技术支持。

2结果与分析2.1CSFV靶基因PCR扩增以猪瘟活疫苗为模板提取RNA，并采用靶基因两端特异性引物进行RT-PCR扩增。琼脂糖电泳显示靶基因条带为500～750bp，与预期大小（568bp）相符（图1）。M：DL2000bp；1：PCR产物；2：空白对照。图1靶基因PCR产物电泳图2.2pTMACC-CSFV装甲RNA结构分析借助蛋白三维模拟器（SWISS-model）对pTMACC-CSFV装甲RNA外壳蛋白（double-CP）结构与野生型MS2噬菌体中single-CP结构分别建模（图2）。纯化的装甲RNA颗粒进行SDS电泳分析（图3、图4），显示目的蛋白位于26～42ku，约是野生型MS2噬菌体外壳蛋白分子质量（13.7ku）的2倍，与建模预测分析一致。该物质溶液经过80℃热处理后，肉眼可见溶液由透明状变乳白色，琼脂糖电泳显示：加热后该物质特征性条带呈弥散性直至消失，源自该装甲RNA颗粒为RNA-蛋白复合物，热处理后蛋白外壳变性，包裹RNA核酸被释放。A:野生型噬菌体MS2中外壳蛋白三维构象模型；B:pTMACC-CSFV中外壳蛋白三维构象模型。图2噬菌体MS2中外壳蛋白改造的蛋白三维构象模型对比M：蛋白分子质量标准；1：pTMACC-CSFV颗粒。图3pTMACC-CSFV装甲RNA颗粒SDS电泳分析M：1kbDNALadder；1：pTMACC-CSFV颗粒(加热前)；2：pTMACC-CSFV颗粒(加热后)。图4pTMACC-CSFV装甲RNA颗粒核酸电泳分析2.3pTMACC-CSFV装甲RNA形态学鉴定纯化的装甲RNA颗粒，经1%醋酸双氧铀染色后，透射电镜观察（图5）：颗粒为“外亮内暗”规则的多边形物质，直径约26nm。该物质经动态光散射图谱分析（图6）：光谱单一，且颗粒粒径主要分布于20～50nm，且均值在26nm左右，表明溶液均匀分布，没有颗粒聚集现象，且粒径大小与透射电镜数据吻合。图5pTMACC-CSFV装甲RNA颗粒透射电镜图图6pTMACC-CSFV装甲RNA颗粒动态光散射图谱2.4装甲RNA颗粒序列溯源性分析该物质测序后核酸序列图谱分析表明，插入靶标序列为猪瘟病毒5’UTR特定序列，溯源至WAOH猪瘟参考实验室法国Thiverval株（位点1～550bp），二者同源性达99%。2.5pTMACC-CSFV装甲RNA质控品均匀性分析pTMACC-CSFV装甲RNA均匀性检测数据分布如图7。采用F

检验统计分析，F=0.513<2.94，且P=0.848，表明该质控品批内精密度和总精密度差异均无统计学意义，呈均匀分布。图7pTMACC-CSFV装甲RNA质控品均匀性分析图2.6pTMACC-CSFV装甲RNA质控品保存稳定性分析pTMACC-CSFV装甲RNA质控品在不同的保存条件下，检测数据统计分布如图8，检测Ct值采用t

检验统计分析。结果显示，冷藏条件下，该质控品稳定保存6个月，-20℃保存条件下该质控品能够稳定保存36个月。图8pTMACC-CSFV装甲RNA质控品保存稳定性及趋势分析图2.7实用性能检测pTMACC-CSFV装甲RNA质控品经8家权威实验室进行性能评估。检测Ct

值在20.12～22.07，符合猪瘟方法核酸阳性质控品的要求，能够应用于猪瘟临床检测。

03讨论猪瘟和非洲猪瘟均是危害世界养猪业的严重传染病，在临床和病理方面难以区分。面临非洲猪瘟疫情防控的严峻形势，猪瘟疫病的监测也刻不容缓。随着猪瘟核酸检测技术的普及，一种安全、稳定、高效的阳性质控物质迫切急需。本研究依托改造后的ArmoredRNA技术，采用了一种新型高效的装甲RNA表达载体。此载体不仅能表达高达2000bp的外源RNA片段，而且优化了纯化工艺，在保证简化工艺的同时提高了装甲RNA颗粒的产量。特定CSFV靶基因插入该表达载体，制备了猪瘟装甲RNA物质。该物质为RNA-蛋白复合物，即猪瘟靶基因对应的RNA核酸被噬菌体外壳包裹，形成类似天然病毒的结构，即核酸不易降解、又无生物安全风险，是良好的核酸检测质控品，能够监测猪瘟病毒相关核酸检测方法中核酸抽提、反转录、扩增全流程，同时避免了质粒作为质控品易污染环境、干扰检测结果等弊端。猪瘟病毒装甲RNA质控品均匀性良好，且稳定性强。在本研究中，-20℃保存环境下检测数据经t

检验，t<0.05，且0.