+3.2基因工程的基本操作程序++第2课时+基因工程基本操作程序的步骤（二）课件-【知识精讲精研】高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第3章

基因工程第2节

基因工程的基本操作程序第2课时

基因工程基本操作程序的步骤（二）基因工程的步骤第一步：目的基因的筛选和获取使用限制性核酸内切酶剪切出目的基因第二步：基因表达载体的构建目的基因与运载体通过DNA连接酶结合第三步：目的基因导入受体细胞第四步：目的基因的检测与鉴定基因工程的步骤1、构建基因表达载体的目的

让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时使目的基因能够表达和发挥作用。2、基因表达载体的组成和功能重组DNA分子目的基因标记基因（抗性基因）终止子复制原点一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因上游，紧挨转录的起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位。能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。启动子一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因下游，使转录在所需要的地方停下来。一、第二步：基因表达载体的构建（核心）基因表达载体自我复制起始的一段序列。3、基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。一、第二步：基因表达载体的构建（核心）（3）受体细胞为原核生物

如以大肠杆菌为受体细胞，先用Ca2+处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。二、第三步：将目的基因导入受体细胞1、将目的基因导入受体细胞的方法（1）受体细胞为植物细胞

花粉管通道法；农杆菌转化法（2）受体细胞为动物细胞

最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中。二、第三步：将目的基因导入受体细胞

方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。

方法二：也可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。2、花粉管通道法——我国科学家独创构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。（1）转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）适用的生物：主要是双子叶植物和裸子植物。

当植物体到损伤时，伤口处分泌酚类吸引农杆菌，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（提前已经把目的基因嵌入）转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。3、农杆菌转化法（3）原理：二、第三步：将目的基因导入受体细胞▌显微注射法将含有目的基因的表达载体采用显微注射仪显微注射到受精卵(卵细胞也还行)；受精后经胚胎早期培养，再移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育成为具有新性状的动物。4、将目的基因导入动物细胞二、第三步：将目的基因导入受体细胞Ca2+转化法（感受态细胞法）使得细胞处于一种能够吸收周围环境DNA的生理状态。5、将目的基因导入微生物细胞▌原核生物适合作为受体细胞的原因：结构简单，繁殖快，易于培养，遗传物质相对少二、第三步：将目的基因导入受体细胞

1、分子水平的检测

（1）检测转基因生物染色体的DNA中是否插入了目的基因。

（2）检测转基因生物的DNA中的目的基因是否转录出了mRNA。

（3）检测目的基因是否翻译出了蛋白质。三、第四步：目的基因的检测与鉴定

目的基因进入受体细胞，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。方法：核酸分子杂交、PCR技术方法：抗原－抗体杂交技术方法：核酸分子杂交、PCR技术

2、个体水平的鉴定（1）通过双抗性基因筛选是否导入三、第四步：目的基因的检测与鉴定1、分子水平的检测（2）用PCR、基因探针等技术检测是否导入原理：DNA分子杂交含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记，以此做基因探针，观察是否出现杂交带。原理：碱基互补配对三、第四步：目的基因的检测与鉴定1、分子水平的检测（4）翻译的检测（是否表达成功）方法：抗原-抗体杂交原理：蛋白质分子的结合具有特异性从转基因生物中提取出蛋白质，用相应的抗体进行抗原抗体杂交。若有反应，表明目的基因已表达合成出蛋白质。（3）转录的检测方法：DNA—RNA分子杂交从转基因生物提取mRNA同样以被标记的目的基因作探针，观察是否出现杂交带三、第四步：目的基因的检测与鉴定1、分子水平的检测看对应生物体是否具有了预期的特性。

2、个体生物学水平的鉴定

对转基因生物进行抗性接种实验，检测其是否具有抗性及抗性程度；或比较基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同。例如：一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，观察植物是否具有了抗虫或者抗病特性。三、第四步：目的基因的检测与鉴定四、DNA片段的扩增及电泳鉴定四、DNA片段的扩增及电泳鉴定1、实验原理（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合；PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环；②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制原理①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可带正电荷或负电荷。②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。（2）琼脂糖凝胶电泳1、实验原理四、DNA片段的扩增及电泳鉴定

4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。2、材料用具四、DNA片段的扩增及电泳鉴定3、方法步骤（1）用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。（2）待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在管的底部。四、DNA片段的扩增及电泳鉴定（3）参照下表参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min预变性使DNA充分变性以利引物和模板更好结合3、方法步骤四、DNA片段的扩增及电泳鉴定（4）用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，常配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，在沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀。（5）将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。3、方法步骤四、DNA片段的扩增及电泳鉴定（6）将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。（7）将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。接通电源，根据电泳槽阴阳极间的距离来设定电压(1～5V/cm)。待指示剂前沿移近凝胶边时停止。3、方法步骤四、DNA片段的扩增及电泳鉴定（8）取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。4、注意事项四、DNA片段的扩增及电泳鉴定①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。

若扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。（2）你进行电泳鉴定的结果是几条条带？若不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。

若扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。5、结果分析与评价四、DNA片段的扩增及电泳鉴定（1）你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？

可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。基因工程的基本操作流程获取质粒、噬菌体等载体筛选和获取目的基因用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体将含有目的基因的表达载体导入受体细胞检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性核心课堂小结1、下列对基因表达载体构建的叙述，不正确的是()A．需要限制酶和DNA连接酶等特殊工具B．基因表达载体中有的含有启动子和密码子C．标记基因不一定是抗生素抗性基因D．基因表达载体的构建是基因工程的核心B2、下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是()A．表达载体中的胰岛素基因可通过胰岛A细胞的mRNA逆转录获得B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点C．借助标记基因筛选出来的受体细胞不一定含有目的基因D．起始密码子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用C课堂练习课堂练习3、研究者从某植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入牡丹中增加其花色类型。下列操作与实验目的不符的是()A．用限制酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒B．用含基因C的农杆菌侵染牡丹的愈伤组织，将基因C导入细胞C．在培养基中添加潮霉素，可以提取出潮霉素抗性基因D．用分子杂交方法检测基因C是否整合到菊花染色体DNA上C课堂练习4、利用PCR扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。以下相关叙述错误的是()A．变性过程中断裂的是DNA分子内碱基对之间的氢键B．复性时引物a必须与引物b碱基互补配对C．由原来的母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物a或引物bD．延伸时需要耐高温的DNA聚合酶催化B1、下列过程中没有涉及碱基互补配对原则的是()A．提取目的基因B．目的基因与载体结合C．将目的基因导入受体细胞D．目的基因的表达和检测C2、利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中，能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是()A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白D作业3、1982年，世界上第一例体型比普通小鼠大1.8倍的转基因“超级小鼠”培育成功。下列相关叙述正确的是()A．将