【虾青素的合成实验探究9700字】

-PAGE7-虾青素的合成实验探究目录TOC\o"1-3"\h\u229361绪论 6214431.1概述 666721.1.1虾青素的结构性质 6294831.1.2虾青素的功能及应用 7175431.2虾青素的生产方法 10226151.3微生物合成虾青素研究现状及进展 10275011.3.1合成生物技术构建微生物细胞工厂概述 10215151.3.2虾青素生物合成路径 11195161.3.3大肠杆菌生产虾青素 12180451.3.4解脂耶氏酵母生产虾青素 1211341.4研究的目的、意义及主要内容 1312602实验材料与方法 13212982.1实验材料 13156312.1.1实验仪器 13301052.1.2实验试剂 14197182.1.3培养基及溶液配制 15228662.1.4菌株、引物 16316542.2实验方法 165632.2.1构建重组解脂耶式酵母工程菌 1672612.2.2摇瓶发酵培养 2084802.2.3虾青素的提取、检测 20171533结果与分析 2138563.1重组酵母菌构建结果 213.1.1整合Leu-PTEFIN-pacrtW-TLIP1片段酵母菌株的构建213907Leu-PTEFIN-pacrtW-TLIP1片段酶切跑胶结果 2113623Y101A01转化子PCR验证结果 223.1.2整合Leu-PTEFIN-pacrtZ-TMIG1片段酵母菌株的构建225286Leu-PTEFIN-pacrtZ-TMIG1片段酶切跑胶结果 2229609Y101A02转化子PCR验证结果 23192303.2重组菌发酵生产虾青素结果 23250754结论与展望 245579参考文献 241绪论1.1概述虾青素（Astaxanthin，又称变胞藻黄素或虾红素），属于叶黄属类胡萝卜素，作为一种脂溶性的色素，可以用于改善养殖鱼的颜色，增加鱼的蛋黄色素沉着，以及用于其他饲料应用，许多海洋生物中都有它的存在。强大的抗氧化活性使其具有重要的经济价值和广泛的应用前景，在食品和化妆品中使用虾青素也引起了越来越多的关注[1]。1.1.1虾青素的结构性质虾青素（C40H52O4）是一种深红棕色粉末，相对分子质量为596.84g/mol，熔点216℃，沸点774℃，密度1.071g/cm3，不易溶于水，易溶于丙酮、乙醇、二氯甲烷、乙醚、正己烷等有机溶剂[2]，化学名为3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素（结构如图1.1），以异戊二烯为基本单位，通过共轭双键连接，两端为两个异戊二烯组成的六元环，其不饱和六元环上还分别具有一个羰基和一个羟基，此结构奠定了虾青素具有超强抗氧化活性。虾青素有三种旋光异构体：左旋3S-3´S，天然提取的虾青素主要呈左旋结构，具有较强的生物学活性[3]；内消旋3R-3´S，抗氧化活性最低；右旋3R-3´R，清除自由基能力最强。图1.1虾青素结构图1.1.2虾青素的功能及应用虾青素除了具有抗氧化活性外，还具有抗癌、抗炎、抗糖尿病等多种健康益处。此外，虾青素是唯一可以穿透血脑和血视网膜屏障并对中枢神经系统和脑功能有积极作用的类胡萝卜素。因此，虾青素被广泛用于食品、医疗保健、化妆品及饲料添加剂中。虾青素的功能抗氧化虾青素六元环上的羰基以及羟基使其易与自由基发生反应，终止自由基的链式反应，起到抗氧化作用[4,5]。（2）抗炎虾青素可以通过调控机体自由基和抗氧化剂之间的平衡发挥间接的抗炎作用。Choi等人[6]的研究表明，虾青素能通过抑制诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2的表达来抑制一氧化氮的产生。虾青素对一氧化氮的这种抑制作用对消炎药物的发展具有重要的影响，可治疗慢性炎症性疾病。（3）抗癌虾青素能够抑制乳腺癌的生长，而其他类胡萝卜素如β-胡萝卜素和角黄素则不具备这一功能。一些研究已经证明虾青素在哺乳动物中的抗肿瘤活性，虾青素可以减少化学诱发膀胱癌的发病率以保护小鼠膀胱癌变[7]。越来越多的研究表明虾青素具有抑癌、抗癌作用，主要体现在虾青素预防肿瘤的发生、增强免疫、增加细胞间通讯等方面，同时虾青素的保护作用比β-胡萝卜素更为明显[8]。（4）预防心血管疾病低密度脂蛋白胆固醇（LDL）的血浓度与动脉粥样硬化的危险性增加密切相关。然而，高密度脂蛋白胆固醇（HDL）血药浓度与冠状动脉心脏疾病呈负相关，是防止动脉粥样硬化的指标。通常LDL的氧化是造成动脉粥样硬化发展的原因[9]。因此，补充抗氧化剂可以减少动脉粥样硬化的危险性。流行病学和临床资料表明，在饮食中加入抗氧化剂可以防止心血管疾病[10]。在动物模型研究中，虾青素的补充可增加血液中的高密度脂蛋白水平[12]。因此，虾青素能够调节血液中的低密度脂蛋白和高密度脂蛋白胆固醇水平，保护心脏的健康。虾青素的应用（1）在营养保健品中的应用随着虾青素生物功能探究的深入和药理药效试验的逐步完善，利用虾青素作为营养保健食品和药品成为一种趋势。虾青素具有抗氧化作用，能有效清除肌细胞中因运动产生的自由基，显著提高人体免疫力[14]，可以预防白内障、动脉粥样硬化、阿茨海默病等由过氧化所引起的疾病[15]。此外，虾青素具有降低LDL、HDL的功能，因此虾青素能预防冠心病和缺血性脑损伤等疾病[16]。（2）在化妆品中的应用由于虾青素的抗氧化和着色功能，可以有效除皱抗衰老、除去年龄增长所产生的黄褐斑等，使虾青素成为优良的化妆品原料。此外，虾青素的吸收峰在450nm左右，跟紫外线的波长相近（380-430nm），因此虾青素能够吸收紫外线，减少皮肤受紫外线的伤害。虾青素能有效清除皮肤中由紫外线照射所产生的自由基，可快速有效的使晒伤的皮肤在短时间内复原[17,18]。（3）在养殖业的应用虾青素为脂溶性，其呈色艳丽且具强抗氧化性，虾青素作为一种鲜红色的着色剂，能够在一些观赏鱼或者虾蟹的皮肤、肌肉以及骨骼中积累，使一些水生动物的皮肤和肌肉出现健康而鲜艳的颜色，增加其营养价值和观赏价值。虾青素在防止水产类产品和禽兽发生疾病方面有同样的功能，可以提高肝功能，增强其免疫力等。Putnam等报道[19]虾青素能增加受精卵的存活率、促进受精能力及改善胚胎发育等。1.2虾青素的生产方法目前，虾青素的生产方法主要依赖化学合成和天然提取两种方式。化学法合成的虾青素成本相对比较低，但存在碳碳双键的扭曲或旋转，导致立体选择性难以控制，使得最终的产物质量难以保证，通常导致活性较低。此外，化学方法合成安全性能低[20]。天然提取虾青素目前主要是利用微生物（红法夫酵母）和藻类（雨生红球藻）提取，但红法夫酵母培养周期长，成本较高，细胞壁坚硬，给下一步的提取带来很大的困难；藻类也存在生长慢和周期长问题，生长条件对环境有很高的要求，而且提取物中有较多的杂质，导致虾青素纯度不高。此外，利用合成生物学方法构建微生物细胞工厂进行发酵生产虾青素，具有低成本、环保、易提取、效率高等优点，生产周期短、不受外部环境的影响，目前在微生物发酵法生产虾青素的相关研究中，通过代谢工程手段改造虾青素合成途径，从而提高虾青素的生产水平是重要研究热点之一。1.3微生物合成虾青素研究现状及进展1.3.1合成生物技术构建微生物细胞工厂概述合成生物学(syntheticbiology)，最初由HobomB.[11]于1980年提出来表述基因重组技术，2003年国际上定义为基于系统生物学的遗传工程和工程方法的人工生物系统研究，从基因片段、DNA分子、基因调控网络与信号传导路径到细胞的人工设计与合成，将工程学原理与方法应用于遗传工程与细胞工程等生物技术领域。与传统生物学通过解剖生命体以研究其内在构造的办法不同，合成生物学的研究方向完全是相反的，它是从最基本的要素开始一步步建立零部件。利用代谢工程及合成生物学手段及计算机工具来操控复杂的多步骤代谢途径，实现目标产物的积累是构建微生物细胞工厂的基础。通常通过蛋白水平表达的调控以及遗传背景改造调节各个模块，各个基因的表达平衡。1.3.2虾青素生物合成路径虾青素的生物合成途径依赖两种五碳前体异戊烯焦磷酸（IPP）和甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。IPP与DMAPP通过虾青素合成基因族编码蛋白的催化作用，经多步缩合反应生成β-胡萝卜素[21]。接下来，以β-胡萝卜素为底物，由β-胡萝卜素酮化酶（crtW）和β-胡萝卜素羟化酶（crtZ）催化进行一系列的连续氧化反应合成虾青素（如图1.2所示）。近年来，越来越多天然合成虾青素的生物体中的代谢路径得到解析，使得虾青素异源生物合成的功能元件库也逐渐壮大。但是，关于不同来源虾青素合成路径的酶反应顺序（先酮化再羟化、先羟化再酮化、酮化与羟化同步）尚不十分明确，并且关于何种生物来源的crtW和crtZ组合能够产生目标构型（3S-3´S）虾青素的信息仍然不够充足。因此，为实现目标构型虾青素在生物体内的高效合成，酮化酶和羟化酶的元件模块库及相关酶学信息需要被进一步扩充，同时双酶催化性能以及两者间的适配性需要进一步被强化。图1.2虾青素合成路径1.3.3大肠杆菌生产虾青素大肠杆菌作为一种成熟的细胞工厂，通过引入异源基因的方式，在大肠杆菌工程菌中构建虾青素合成途径,再通过高密度发酵方法生产虾青素,是一种虾青素工业化生产的优良选择,具有周期短,成本低,提取容易等优点。目前国际上Robet.M.B.等人[22]报道的大肠杆菌工程菌补料分批发酵，虾青素最高产量达到了432mg/L（7.12mg/gDCW）。国内也有实验室研究构建、筛选高产虾青素的大肠杆菌E.coli-LY01，使其在摇瓶中产量达到了10mg/gDCW，建立了一套大肠杆菌高密度发酵工艺，但并未实现虾青素工业化生产[25]。大肠杆菌含有内毒素，大规模发酵时存在被噬菌体侵染的风险使其安全性不高，同时，由于其复杂的合成代谢途径，减少副产物比例，提高产物纯度也有待思考。1.3.4解脂耶氏酵母生产虾青素解脂耶氏酵母是一种产油酵母，其自身可以合成大量乙酰辅酶Ａ供萜类合成，另外该宿主体内的油脂也有利于萜类的储存，因此解脂耶氏酵母可视为一种利于萜类合成的优秀宿主[23]。相比红发夫酵母，解脂耶氏酵母除了使用葡萄糖，乙醇等作为碳源外，还可以使用疏水有机物质，例如烷烃，脂肪酸，油等作为碳源，且其周期更短、更易培养，而且由于遗传操作简单可控则相对更容易获得高纯度的虾青素发酵产品。2017年，Kildegard等人[24]构建了工程化解脂耶氏酵母生产虾青素，产量为10.4±0.5mg/L，在优化了crtZ和crtW的拷贝数后于微量滴定板上培养，使虾青素产量达到了54.6mg/L。解脂耶氏酵母自身具有MVA途径，可将胞内的乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）转化生成异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），IPP和DMAPP又在法尼基二磷酸合酶或香叶基香叶基焦磷酸合酶作用下缩合成了香叶基焦磷酸（GPP）、法尼基焦磷酸（FPP）和香叶基香叶基焦磷酸（GGPP），提供各种萜类化合物生物合成的重要前体物质。近年来，研究者们利用代谢工程及合成生物学技术已实现了多种萜类化合物合成途径在解脂耶氏酵母底盘细胞中的重构与优化。1.4本课题研究的目的、意义及主要内容由于虾青素在众多领域中均具有较高的开发利用价值，这使得其需求量日益增长，利用代谢工程及生物合成技术对解脂耶氏酵母的MVA途径进行改造有望为虾青素的合成积累含量更为丰富的直接底物，同时，解脂耶氏酵母对于降低合成虾青素的生产成本具有重要意义，因而选择解脂耶氏酵母成为异源合成虾青素潜在理想的微生物细胞工厂。本研究利用虾青素相关合成基因以及已构建的酵母整合质粒Leu-L-TEFIN-pacrtW-pacrtZ-Leu-R，构建解脂耶式酵母工程菌。通过电转化法将质粒中目标DNA片段依次转化至解脂耶式酵母中，得到含有-pacrtW-pacrtZ-的解脂耶式酵母工程菌通过酵母基因组提取、转化子PCR验证是否得到正确目标菌株；对目标解脂耶式酵母工程菌进行摇瓶发酵；4、通过高效液相色谱法测试目标解脂耶式酵母工程菌生产虾青素的能力。2实验材料与方法2.1实验材料2.1.1实验仪器本研究所用的主要仪器如下表2.1所示。表2.1实验仪器仪器型号生产商电热恒温培养箱DHP-9162太仓市华利达实验设备有限公司微型离心机Mini7K北京时代北利离心机有限公司电泳仪DYY-6C北京六一生物科技有限公司电泳蓝光切胶仪Labasiss智城超净工作台ZHJH-C1209B上海智城分析仪器制造有限公司生化培养箱SPX-70BII力辰科技邦西仪器科技有限公司恒温恒湿振荡培养箱BS-2FS苏州威尔实验用品有限公司冷冻离心机MICRO17R赛默飞世尔科技有限公司超纯水系统Direct-Q5UV-R苏州赛恩斯仪器有限公司数显型双加热块干浴DryBlockHEATER2德国IKA艾卡集团冰箱BCD-642WD青岛海尔股份有限公司立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50KBS上海申安医疗器械厂制冰机IMS-20常熟市雪科电器有限公司超低温冰箱FORMA991日本Sanyo公司电热恒温水浴锅DK-S24上海精宏实验设备有限公司涡旋仪VortexGenie2ScientificIndustries，USA移液枪Eppendorf德州曼巴商贸有限公司梯度型PCR仪A300杭州朗基科学仪器有限公司电转杯2.1.2实验试剂本研究所用的主要试剂如下表2.2所示。表2.2实验主要试剂试剂生产商葡萄糖生工生物工程(上海)股份有限公司酵母粉oxoid蛋白胨oxoid琼脂粉生工生物工程(上海)股份有限公司HindIII、XhoI、BamHI限制性内切酶NewEnglandBiolabsDNAMarkerNewEnglandBiolabs琼脂糖GENVIEW核酸染料北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒天根生化科技(北京)有限公司DNA纯化试剂盒天根生化科技(北京)有限公司75%乙醇浙江欧洁科技股份有限公司无水乙醇国药集团化学试剂有限公司DNA提取液=25:24:1（酚氯仿）Solarbio乙酸钠国药集团化学试剂有限公司TrizmabaseVETECdNTPTransGenBiotechFastTaqTransGenBiotechsorbitol2.1.3培养基及溶液配制1、YPD培养基：酵母粉20g/L，葡萄糖40g/L，蛋白胨40g/L，溶解定容后分装各50ml到锥形瓶中，并在121℃下高压蒸汽灭菌20min。配制固体培养基时，每个瓶中加入1.0g琼脂。将以上灭菌后固体培养基加热溶解，稍加冷却，再向100ml培养基中加入对应的氨基酸母液（100mg/ml），充分混匀后倒平板。最后，在紫外光下放置15分钟左右，待凝固后倒置放于4℃下保存备用。2、YPD试管培养基：酵母粉20g/L，葡萄糖40g/L，蛋白胨40g/L，取2ml至试管中。3、YPDG发酵培养基：在YPD培养基的基础上加10g/LD-(+)-半乳糖。4、50×TAE电泳缓冲液：242g的2mol/LTris，37.2gEDTA（pH=8.0），加去离子水充分搅拌溶解，57.1ml1mol/L冰醋酸溶液混匀，定容至1L。5、琼脂糖凝胶：带上手套，称取1g琼脂糖于锥形瓶中，加入1×TAE缓冲液，微波炉中加热沸腾4-5次，充分溶解，放于室温冷却至50-60℃，倒入胶板模具中，插上梳子，静置待凝固后取出梳子，放入电泳槽或冰箱中备用。DNA染料：500μLMarker加25μL染料，1mlloading加100μL染料。2.1.4菌株、引物本研究所用的主要菌株及引物如下表2.3、2.4所示。表2.3实验所用菌株菌种名描述来源Y101B05MYA-2613,Δku70::hisG,实验室保存IntE::PGPD-GGS1-TLIP1-PEXP1-crtYB-TMIG2-PTEFIN-crtI-TMIG2Y101A01Yl01B05,ku70::Leu2-PTEFIN-pacrtW-TLIP11本研究Y101A02Y101A01,ku70::Leu2-PTEFIN-pacrtW-TLIP1-PTEFIN-pacrtZ-TMIG1本研究表2.4实验所用引物引物名序列PaW_FTTTggtctcggATGGGACCCGGCATCCAGPaW_RTTTggtctctcTTAGGCGAGGGCGGCGCCPaZ_FTTTggtctcggAACCGCAGCTGTGGATCTGGAACGCCCTGATCGPaZ_RTTTggtctctgTTACTTGCCAGAGGCGGGCTCGTGAL4-RFctcgagagagacgcgtctcgATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAACGAL4-RRTAAgggcccGGGCATAAAATCCAACGGAGAL80-RRctcgagagagacgcgtctcgATGGACTACAACAAGAGATCTTCGGAL80-RFTAAgggcccGGGAAAAGCAGTGGCATTACHph1-FTCTGTTTAGCTTGCCTCGTCCHph1-RACTGTCGAACTTTTCGATCAGAAGAL80t_FAAGCATCTTGCCCTGTGCTTGAL80t_RCTggatccCTACTAAGGAAATTTGATATTTCAAATGT2.2实验方法2.2.1构建重组解脂耶式酵母工程菌对构建好并测序正确的P.aranatis来源的crtW-crtZ基因的重组载体逐步转化到带有异源MVA途径的产β-胡萝卜素的解脂耶式酵母菌株中，构建流程如下图2.1所示。其中，Leu2-PTEFIN-pacrtW-TLIP1-PTEFIN-pacrtZ-TMIG1整合质粒为实验室已构建质粒，酶切所用酶为限制性核酸内切酶HindⅢ、XbaI、BamHI；胶收采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。图2.1重组解脂耶式酵母工程菌构建流程酶切反应用限制性核酸内切酶HindⅢ和XbaI或BamHI和XbaI组合对整合质粒以及对含Leu同源臂的载体进行双酶切处理，酶切体系如下表2.5所示。体系配制完成离心混匀后将反应体系置于37℃恒温培养箱中，过夜酶切（不超过16h）。表2.5含Leu同源臂的载体及crtW/crtZ酶切体系ddH2O33μl10×Buffer5μlcrtW/crtZ10μlHindⅢ/BamHI1μlXbaI1μl总体积50μl琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物本实验使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物。（1）配制足量50×TAE电泳缓冲液，将其稀释后倒入电泳槽中，使槽中液面保持水平，多余置于4℃冰箱中保存；（2）根据DNA片段的大小配制合适的琼脂糖凝胶，倒入制胶板中，插上对应尺寸的梳子，待凝固后缓缓拔出梳子，保持胶体完整并将其放入电泳槽中，有点样孔的一端朝向负极，保证电泳缓冲液没过胶体。一般为大孔胶，按两等分规格插入梳子；（3）平衡吸附柱：将吸附柱中加入500μLBL平衡液，在12000rpm转速下离心1min，弃废液后放于4℃冰箱中备用；（4）点胶：在酶切产物中以5:1加入DNAloading后，一般同一样品以三个点样孔为一组进行上样。进行琼脂糖凝胶电泳时，调节电泳仪电压为160V，电流为180-200mA左右，计时30-40min，达到将目的DNA片段尽可能地与无关条带分离的效果；（5）切胶：在蓝光仪下回收分子量较大的目标条带，尽可能地切去中间透明部分并保留荧光部分以保证相对较高的浓度，将切下的胶置于1.5ml干净的离心管中；（6）胶收：在盛有胶块的EP管中加入500μL的PN溶液，在55℃的金属浴中融胶10min，不时颠倒，胶块完全融化后在室温下放置2min；（7）吸附：将已融化胶液用枪转移至事先已平衡好的吸附柱中，将吸附柱做好标记，放于4℃冰箱中10min。结束后取出吸附柱，12000rpm转速下离心10sec，将下层液倒回，重复上述步骤一次，倒掉废液；（8）漂洗：在吸附柱中加入600μLPW溶液（含有EtOH），12000rpm转速下离心10sec，弃废液，再加600μLPW溶液，12000rpm转速下离心2min，将收集管开盖置于55℃金属浴中10min；（9）准备新的EP管，做好标记，收集管置于其中，在吸附柱白色部分处逐渐加入45μLEB溶液，勿碰蓝边，于55℃金属浴中闭盖10min，结束后12000rpm转速下离心2min，收集产物置-20℃冰箱保存备用。解脂耶式酵母电转化法本实验采用Yarrowialipolytica最新电转化法（2018）将酶切回收所得转化至解脂耶式酵母底盘菌中。将酵母甘油菌接种于2mlYPD试管培养基中，28℃，225rpm过夜培养21h，再按20%的接种量转接一次，相同条件下培养3h；收集菌液至1.5mlEP管中，4℃，4500rpm离心2min，弃上清，收集细胞。用预冷的1Msorbitol重悬并清洗细胞，同上离心，收集细胞，加入1Msorbitol重悬细胞，使OD600=30；取200μL感受态细胞至0.2cm电转杯，加入5μgDNA；2.7kV电击后，立即加入600μL上述培养基两次，并转移至试管中复苏1-8h后涂板（若为抗生素型则用1Msorbitol清洗2次后涂板）。菌株筛选在涂板长出菌落的平板中挑取单菌落划线分纯，37℃下培养1-2天，再挑取单菌落至试管培养基中过夜培养，次日存甘油菌。酵母基因组的提取（1）对离心机提前设置4℃降温，金属浴55℃升温；（2）将菌液置于1.5mlEP管中，12000rpm转速下离心30sec，上清用枪吸尽；（3）加入与沉淀细胞等体积的石英砂，300μLSTES，300μL氯仿（取下层），涡旋10min；（4）加入300μLEB溶液后高速涡旋30sec，4℃，12000rpm转速下离心10min；（5）室温下取上层水相400μL（用200μL枪精确吸2次）转移至一个干净的EP管中，加入40μL3mol/L乙酸钠，1ml4℃预冷无水乙醇，颠倒混匀，-20℃静置超过15min；（6）4℃，12000rpm转速下离心10min，出现白色沉淀，弃上清；（7）加入1ml4℃预冷75%乙醇，清洗弃上清，再加入1ml4℃预冷75%乙醇，倒置，用纸巾吸干；（8）55℃金属浴烘干10min，出去残留乙醇；用10μLEB缓冲液或无菌水重悬，混匀离心，-20℃保存。转化子PCR验证取酵母基因组备用，配制菌落PCR体系，设置反应程序，详见下表。表2.6菌落验证PCR体系加H2O至20μL15.5μL10×FastTaqbuffer2μLdNTP(10mM)0.5μLPrimerF(10mM)0.4μLPrimerR(10mM)0.4μLFastTaq0.2μL基因组1μL总体积20μL表2.7验证PCR程序步骤反应温度反应时间反应循环数94℃5min194℃10secTm±2℃15sec2572℃视片段长度而定30sec/kb72℃5min14℃pause程序结束后，用琼脂糖凝胶电泳验证，若转化子验证正确，说明转化成功，则所存甘油菌可作为目标解脂耶式酵母菌株进行进一步发酵测试。2.2.2摇瓶发酵培养以原宿主菌为对照进行发酵培养。（1）菌种活化：将-80ºC保藏的酵母甘油菌按1%接种量接种于5mLYPD试管培养基中，30ºC、250rpm培养16-20h，使OD600=7-8；（2）一级扩大培养：将试管培养基中菌液以初始OD600=0.2计算接种至25mlYPD摇瓶中，30ºC、250rpm培养至对数生长期，OD600=5-6；（3）发酵培养：将一级培养基中菌液按初始OD600=0.5计算量接种至50mLYPDG发酵培养基中，30ºC、250rpm培养48或66h，做平行试验。2.2.3虾青素的提取、检测（1）发酵结束后，取两等份的发酵液，4000rpm离心2min收集菌体，并水洗两次；（2）其中一份菌体80℃烘干至恒重，称重计算细胞干重；（3）另一份菌体用于虾青素产物提取，具体方法：用1ml3MHCL重悬细胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后立即冰浴5min；将破碎的细胞12000rpm、4℃离心2min，弃上清，用超纯水清洗两次后加入1ml含1%（w/v）BHT的丙酮，并涡旋2-3min；最后离心收集丙酮相，用0.22μm滤膜过滤后准备上液相检测；（4）HPLC检测，详见下表。表2.8高效液相色谱法测定虾青素含量体系条件参数色谱柱EclipsePlusC18柱流动相A通道：纯甲醇；B通道，乙腈：超纯水=9:1；C通道，甲醇：异丙醇=3:2流速1.0ml/min柱温25℃紫外检测波长450nm上样体积10μL3结果与分析3.1重组酵母菌构建结果3.1.1整合Leu-PTEFIN-pacrtW-TLIP1片段酵母菌株的构建对已构建的整合质粒进行酶切，获得了Leu-PTEFIN-pacrtW-TLIP1片段，再经酵母电转化法将DNA片段整合到解脂耶式酵母底盘细胞中，获得了重组菌株Y101A01。Leu-PTEFIN-pacrtW-TLIP1片段酶切跑胶结果已知原有重组质粒的总长度为7955bp，Leu-PTEFIN-pacrtW-TLIP1片段长度为1813bp。从重组质粒中通过HindIII及xbaI双酶切得到Leu-PTEFIN-pacrtW-TLIP1片段，由图可见，酶切条带分别在1000-2000bp和5000-8000bp左右，1000-2000bp处的条带与目标片段长度相符合，初步验证酶切成功，继而将条带进行回收送测，测序正确后进行后续酵母转化实验。图3.1酶切产物胶收图注：M：Maker；1：目标片段Y101A01转化子PCR验证结果用引物验证Leu-PTEFIN-pacrtW-TLIP1是否整合到底盘细胞当中，验证结果如下图所示。对此转化子进行验证所用双引物分别为GAL80-RR和GAL80-RF，由图可见，胶图中出现条带，且通过跑胶所得条带的长度在1000bp-2000bp之间，另以GAL4-RF和GAL4-RR为引物进行PCR验证，胶图没有出现片段，说明目标片段成功转化到原宿主菌中，得到了Y101A01工程菌。图3.2转化子PCR验证胶图注：M：Maker；1：以GAL4-RF和GAL4-RR为引物；2：以GAL80-RR和GAL80-RF为引物3.1.2整合Leu-PTEFIN-pacrtZ-TMIG1片段重组酵母菌株的构建将酶切正确Leu-PTEFIN-pacrtZ-TMIG1片段经酵母电转化法整合到重组菌株Y101A01中，经转化子PCR验证获得了重组菌株Y101A02。与上述3.1.1重组菌株构建相似，区别在于所使用的限制性核酸内切酶不同以及引物不同。Leu-PTEFIN-pacrtZ-TMIG1片段酶切跑胶结果已知原有重组质粒的总长度为7955bp，Leu-PTEFIN-pacrtZ-TMIG1片段长度为1573bp。从重组质粒中通过BamHI及xbaI双酶切得到Leu-PTEFIN-pacrtZ-TMIG1片段，由图可见，酶切条带分别在1000-2000bp和5000-8000bp左右，1000-2000bp处的条带与目标片段长度相符合，初步验证酶切成功，继而将条带进行回收送测，测序正确后用于后续酵母转化实验。图3.3酶切产物胶收图注：M：Maker；2：目标片段Y101A02转化子PCR验证结果用引物验证Leu-PTEFIN-pacrtZ-TMIG1是否整合到底盘细胞当中，验证结果如下图所示。对此转化子进行验证所用双引物分别为Hph1-F和Hph1-R，由图可见，胶图中出现条带，且通过跑胶所得条带的长度在2000bp-3000bp之间，另以GAL80t-F和GAL80t-R为引物进行PCR验证，胶图没有出现片段，说明目标片段成功转化到原宿主菌中，得到了Y101A02工程菌。图3.4转化子PCR验证胶图注：M：Maker；1：以GAL80t-F和GAL80t-R为引物；2：以Hph1-F和Hph1-R为引物3.2重组菌发酵生产虾青素结果图3.5解脂耶氏酵母工程菌发酵产物HPLC检测结果注：1：虾青素；2：β-胡萝卜素由摇瓶发酵可以观察到，工程菌Y101A02发酵菌体颜色比原宿主菌更红，推测其产各类类胡萝卜素的能力更强，从而推测其产虾青素的能力有所提高。虾青素标准品的保留时间为10.8min，由图3.5可知，在工程菌Y101A02的发酵产物中检测到了虾青素的存在，经计算虾青素产量为6.12mg/L。由Y101A02发酵产物HPLC的峰图可见，除虾青素外可能还存在玉米黄质、角黄素、番茄红素等中间产物，并且虾青素的产量较低，说明crtW、crtZ对底物的亲和力有待进一步提高，酶的催化活性以及专一性均处于较低水平。4结论与展望本文以产β-胡萝卜素解脂耶式酵母工程菌为宿主菌，在已整合构建了含crtW、crtZDNA片段质粒的基础之上，构建用于生产虾青素的解脂耶式酵母重组菌株，主要结论如下：通过酶切及琼脂糖凝胶电泳，在蓝光仪中观察到所得含crtW、crtZDNA片段大小与之前实验中记录数据相符，因而得到正确的酶切产物，可用于后续的酵母转化实验；将酶切正确的LEU臂_pacrtW/pacrtZ片段通过酵母电转化整合到底盘细胞中，最终通过菌落PCR验证成功得到重组整合Leu-L-TEFIN-pacrtW-pacrtZ-Leu-R解脂耶式酵母工程菌；将重组菌进行发酵，发酵产物通过高效液相色谱在450nm检测波长下成功检测到虾青素，最终得到虾青素的产量为6.12mg/L。本研究虽成功构建了生产虾青素的解脂耶式酵母工程菌，但虾青素的产量仍处于过低水平，且存在中间产物的积累，酶的表达水平低以及底物专一性弱成为主要原因，说明通过对crtW、crtZ这两个靶点进行系统筛选、优化，有望提高转化效率，减少中间产物的积累，提高虾青素的产量。为实现目标构型虾青素在生物体内的高效合成，对不同来源的crtW、crtZ进行整合构建重组酵母菌，通过这种方式为获得高转化率的虾青素合成元件模块库，进一步改善crtW、crtZ底物专一性、催化活性并实现适配组合提供条件。参考文献[1]GuerinM,HuntleyME,OlaizolaM.Haematococcusastaxanthin:applicationsforhumanhealthandnutrition[J].Trendsbiotechnology,2003;21(1):210-216.[2]HusseinG,SankawaU,GotoH,etal.Astaxanthin,acarotenoidwithpotentialinhumanhealthandnutrition[J].Journalofnaturalproducts,2006,69(3):443-449.[3]KupcinskasL,LafolieP,LignellÅ,etal.Efficacyofthenaturalantioxidantastaxanthininthetreatmentoffunctionaldyspepsiainpatientswithorwithout(Helicobacterpylori)infection:Aprospective,randomized,doubleblind,andplacebo-controlledstudy[J].Phytomedicine,2008,15(6):391-399.[4]张婧.利用嗜热链球菌发酵虾头回收虾青素等营养物质的研究[D].中国海洋大学,2013.[5]McNultyH,JacobRF,MasonRP.Biologicactivityofcarotenoidsrelatedtodistinctmembranephysicochemicalinteractions[J].TheAmericanjournalofcardiology,2008,101(10):20-29.[6]ChoiSK,ParkYS,ChoiDK,etal.EffectsofastaxanthinontheproductionofNOandtheexpressionofCOX-2andiNOSinLPS-stimulatedBV2microglialcells[J].Journalofmicrobiologyandbiotechnology,2008,18(12):1990-1996.[7]TanakaT,MorishitaY,SuzuiM,etal.Chemopreventionofmouseurinarybladdercarcinogenesisbythenaturallyoccurringcarotenoidastaxanthin[J].Carcinogenesis,1994,15(1):15-19.[8]TanakaT,MakitaH,OhnishiM,etal.Chemopreventionofratoralcarcinogenesisbyrallyoccurringxanthoplls,astaxanthinandcanthaxanthin[J].Cancerresearch,1995,55(18):4059-4064.[9]FreiB.Cardiovasculardiseaseandnutrientantioxidants:Roleoflow-densitylipoproteinoxidation[J].Criticalreviewsinfoodscienceandnutrition,1995,35(1-2):83-98.[10]KritchevskySB.β-Carotene,carotenoidsandthepreventionofcoronaryheartdisease[J].Thejournalofnutrition,1999,129(1):5-8.[11]HobomB.Genesurgery:onthethresholdofsyntheticbiology[J].Medizinischeklinik,1980,75(24):834-841.[12]MurilloE.Efectohipercolesterolemicodelacantaxantinaylaastaxantinaenratas[J].Archivoslatinoamericanosdenutricion,1992,42(1):409-413.[13]LorenzRT,CysewskiGR,Commercialpotentialformicroalgaeasanaturalsourceofastaxanthin[J].Trendsinbiotechnology,2000,18(4):