第八章 细胞凋亡

概述细胞凋亡过程与机制细胞凋亡与疾病细胞凋亡的检测

第八章细胞凋亡编辑课件悉尼·布雷诺尔罗伯特·霍维茨约翰·苏尔斯顿2002年诺贝尔生理与医学奖获得者概述编辑课件

一、细胞死亡的模式■Necrosis=细胞病理性死亡■Apoptosis=细胞自发性死亡坏死凋亡编辑课件apoptosis编辑课件Conceptofapoptosis:体内外生理或病理因素触发细胞内死亡程序→细胞死亡编辑课件细胞坏死与细胞凋亡的区别编辑课件细胞凋亡与细胞坏死的区别特征细胞凋亡细胞坏死诱导因素生理及弱刺激强烈刺激受累范围单个细胞丧失成群细胞死亡膜完整性保持到晚期早期即丧失细胞体积减小、固缩增大肿胀染色质凝聚成半月形稀疏成网状细胞器无明显变化肿张破坏溶酶体保持完整破坏外溢细胞形状形成凋亡小体破裂成碎片基因组DNA有控降解随机降解大分子合成一般需要不需要基因调控有无后果不引起炎症反响引起炎症反响意义生理死亡方式病理死亡方式编辑课件凋亡的生理学意义:■胚胎发育期去除某些细胞■维持内环境稳定增殖细胞群中细胞去除、去除潜在有害的自身反响性淋巴细胞■参与防御反响细胞毒T细胞凋亡过多或缺乏→→疾病：肿瘤、艾滋病、神经变性性疾病、缺血性损伤编辑课件

二、凋亡时细胞的主要变化1.形态学改变〔Themorphologiccharacteristicsofapoptosis〕

凋亡细胞〔实体细胞〕与周围细胞脱接触胞膜空泡化〔Blebbing〕细胞固缩〔Condensation〕、核固缩和发芽凋亡小体〔Apoptoticsmallbody〕编辑课件细胞凋亡编辑课件(扫描电镜)正常细胞(扫描电镜)(透射电镜)

凋亡细胞—凋亡小体编辑课件DNA片断化caspase激活灭活凋亡抑制物水解活性蛋白水解结构蛋白Ca2+/Mg2+

Zn2+核酸内切酶激活①②③2.生化改变〔Thebiochemicalcharacteristicsofapoptosis〕钙超载编辑课件■DNA片段化〔DNAladdingpattern〕核酸内切酶激活

核小体连接区DNA降解180～200bp整数倍的DNA片段编辑课件

■细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻编辑课件凋亡的过程及机制凋亡诱导因素死亡信号凋亡相关基因激活

Caspases激活、DNase激活凋亡的执行

巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞凋亡细胞清除

编辑课件凋亡的机制编辑课件细胞凋亡的两条通路：死亡受体途径、线粒体途径编辑课件〔1〕死亡受体途径

〔deathreceptorpathway〕死亡受体〔deathreceptor,DR〕肿瘤坏死因子受体超家族成员，跨膜蛋白，与相应配体结合传递细胞信号

Fas(CD95),TNFR1,RAIL-R2/DR5编辑课件参与死亡受体信号转导的接头蛋白：死亡结构域蛋白〔deathdomainprotein,DD〕TRADD：TNF受体相关死亡结构域蛋白TNF+TNFR1〔死亡结构域〕+TRADD→→细胞凋亡FADD：Fas相关死亡结构域蛋白FasL+Fas〔死亡结构域〕+FADD→→细胞凋亡

编辑课件FasL+Fas凋亡诱导复合物〔DISC〕

FADD〔C端DD结构域与Fas胞内段结合N端DED结构域与无活性caspase8酶原交联〕caspase8酶原聚集到复合物上一系列caspase激活细胞凋亡

编辑课件FADD〔Fas-associateddeathdomain〕DD〔deathdomain〕DED〔deatheffectordomain〕FSALFADDPro-caspase-8Caspase-8Caspase-3Pro-caspase-3细胞凋亡FasDEDDEDDD编辑课件编辑课件〔2〕线粒体途径线粒体释放细胞色素C→→细胞凋亡

PT孔开放→线粒体跨膜电位↓，细胞色素C释放促凋亡蛋白Bax促PT孔开放抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl抑制PT孔开放编辑课件细胞色素C+Apaf-1+caspase9前体—凋亡体

召集并激活caspase3→→细胞凋亡Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子编辑课件膜通透性↑、线粒体肿胀、△

m↓Apaf-1活化Cyt.c线粒体途径〔mitochondrialpathway〕Ca2+NO缺氧活性氧应激PT开放Cyt.c+Pro-caspase-9Caspase-9ATPApaf-1+Apaf-1活化Cyt.cCARDApoptosomeAIFcaspase-independentapoptosisPro-Caspase-3凋亡Caspase-3BidCaspase-8编辑课件Caspase依赖的细胞凋亡

〔Caspase-dependentapoptosis〕Caspase特点：--以酶原的形式存在--酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性--水解天冬氨酸C端肽键故称Caspases(Cysteine，asparticacid，protease)

编辑课件Caspase家族的分类凋亡启动亚类Caspase蛋白酶：Caspase8，Caspase9，Caspase10凋亡效应亚类Caspase蛋白酶：Caspase3，Caspase6，Caspase7ICE(interlukin-1βconvertingenzyme)亚类Caspase蛋白酶：参与炎症反响Caspase1，Caspase4，Caspase5，Caspase11,Caspase12，Caspase13，Caspase14编辑课件■Caspase通路分类

启动亚类〔Caspase-8,-9,-10〕效应亚类〔Caspase-3,-6,-7〕▲

Caspase死亡受体途径线粒体途径大小亚基结合（二聚体）caspase激活（四聚体）■

Caspase激活形式Pro-caspase：NH2末端结构域、20KD亚基、10KD亚基剪切编辑课件编辑课件Caspase可激活CAD(caspase-activatedDNase)核酸酶，该酶在核小体的连接区将DNA切断，形成约200bp整倍数的核酸片段正常情况下，CAD与抑制物ICAD-DFF-45结合，存在于胞质中，无活性Caspase活化后降解抑制物ICAD，CAD激活并入核降解DNA使其片段化编辑课件Pro-caspase-2caspase-2Pro-caspase-6Caspase-6Pro-caspase-7caspase-7Pro-caspase-9ICAD（抑制性CAD）CAD（caspase活化DNA酶）CDA进入细胞核内降解DNA细胞凋亡剪切细胞内结构蛋白caspase-9EffectorcaspaseCaspase-3Pro-caspase-3编辑课件Caspase的作用编辑课件Caspase非依赖的细胞凋亡〔Caspase-independentapoptosis〕■凋亡诱导因子〔AIF〕线粒体蛋白AIF释放到胞质内与抑制凋亡的因子结合，从而促发凋亡

■钙超载编辑课件钙超载引起凋亡机制胞浆[Ca2+]↑■激活核转录因子，加速凋亡相关基因的转录■激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链■激活谷氨酰胺转移酶，使细胞骨架分解→凋亡小体细胞凋亡编辑课件细胞凋亡的调控凋亡相关因素凋亡信号的转导凋亡相关基因编辑课件（Themainlyinducedfactorsofapoptosis）

Table：Influencefactorsofapoptosis

诱导性因素（Inducers）抑制性因素（Inhibitors）理化因素射线、高温、强酸、细胞因子IL-2、NGF等强碱、应激、抗癌药激素ACTH、睾丸酮、雌激素激素和因子糖皮质激素、TNF其它Zn2+、苯巴比妥、半胱氨免疫性因素CTL分泌的粒酶酸蛋白酶抑制剂、EBV、病原体因素HIV、HCV牛痘、病毒、中性氨基酸

1、影响细胞凋亡的因素编辑课件2、凋亡信号转导的特点①多样性：不同种类细胞有不同的信号转导系统②偶联性：死亡信号转导系统与细胞增殖、分化过程中的信号转导系统在一些环节上交叉、偶联③同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统引起细胞凋亡④多途性：同一凋亡诱导因素可经过多条信号途径触发细胞凋亡编辑课件3、细胞凋亡的调控基因

〔Regulatedmechanismofapoptosis〕表1细胞凋亡的调控基因

功能基因抑制凋亡基因Bcl-2Bcl-XL、A1/Bfl-1、Bcl-w、Bcl-G和Mcl-1等促凋亡基因P53、Bax、Bad、Bak、Bid、Bim、Bik、Bok、Bcl-B、Bcl-Xs、Krk、Mtd、Nip3、Nix、Noxa等双向调控基因c-myc、Belx编辑课件Bcl-2基因〔Bcelllymphoma/leukemia-2〕广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种瘤细胞Bcl-2家族已发现15个成员，可分为3个亚族：Bcl-2亚家族：抑制细胞凋亡Bax亚家族：促进细胞凋亡BH3亚家族：促进细胞凋亡编辑课件编辑课件Bcl-2抑制凋亡机制：■

抑制线粒体PT孔开放，Cyt.c、AIF释放↓■结合和灭活Apaf-1，阻断caspase-9活化■特异性结合细胞色素C■维持细胞钙稳态编辑课件c-myc,bcl-x促进增殖c-myc(转录调节因子)诱导凋亡Bcl-XL→抑制凋亡Bcl-xBcl-Xs→促进凋亡GF编辑课件p53促凋亡机制：--与Bcl-2基因相互作用，下调Bcl-2的表达--诱导线粒体内凋亡的相关蛋白〔Bax等〕表达，并触发细胞色素C释放和caspase活化--诱导死亡受体Fas表达

编辑课件C-myc双向调控凋亡调控细胞周期基因，编码的蛋白是DNA结合蛋白，调控基因转录。GF充足时主要激活介导细胞增殖的基因GF缺乏时激活凋亡基因编辑课件

凋亡与疾病〔Diseasesassociatedtoapoptosis〕

表：与细胞凋亡异常相关的疾病

凋亡不足凋亡过度肿瘤肝癌、恶性血液肿瘤、乳腺癌发育异常气管-食管瘘、房（室）间隙缺、膀胱癌、肺癌、胶质瘤、前损、唇（腭）裂、短肢畸形、列腺癌等尿道下裂以及多囊肾等发育异常先天性消化道、胆道、肛门狭CNSAlzheimer病、Parkinson病、窄或闭锁、动脉导管未闭、两肌萎缩性侧索硬化症、色素性性畸形、甲状舌骨囊肿等视网膜病，脊肌肉萎缩、早老免疫系统系统性红斑狼疮、糖尿病、类性痴呆风湿性关节炎、桥本甲状腺炎免疫系统免疫缺陷病、AIDS、多发性的硬化症等编辑课件〔一〕细胞凋亡缺乏〔Apoptosisinhibition〕1.肿瘤〔Tumor〕■bcl-2基因过表达85%滤泡状和20%弥漫性B细胞淋巴瘤染色体t〔14;18〕易位IgH基因与bcl-2基因拼接bcl-2基因活化细胞凋亡速率↓肿瘤发生〔乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、胶质瘤等也存在Bcl-2高表达〕编辑课件■p53基因缺失或突变p53的稳定性、细胞内定位或〔和〕活性异常p53表达或功能缺陷细胞凋亡率↓肿瘤发生

■病毒的癌基因HBV编码的HBX是Caspase-3的强效抑制物，与肝癌发生密切相关编辑课件■异常融合蛋白慢性髓细胞性白血病〔CML〕染色体易位t(9；22)Bcr-abl融合基因〔p210Bcr-abl蛋白质〕NF-B活化、细胞凋亡速率↓髓系祖细胞的克隆扩增肿瘤发生编辑课件2．自身免疫病〔Autoimmunediseases〕针对自身抗原的免疫细胞未被及时去除，机体产生针对自身抗原的体液免疫和细胞免疫，导致器官组织损伤。编辑课件〔二〕细胞凋亡过度〔Apoptosisexcess〕1.心肌缺血与缺血-再灌注损伤■特点▲缺血早期以凋亡为主，晚期以细胞坏死为主。▲在梗死灶的中心以坏死为主，梗死灶周边以凋亡为主；▲轻度缺血以凋亡为主，重度缺血以坏死为主；■机制▲氧化应激▲Fas通路▲p53基因转录增加编辑课件细胞凋亡在疾病防治中的意义㈠合理利用凋亡相关因素1.诱导靶细胞凋亡

放疗、化疗

高热、高温2.减少细胞凋亡：NGF、促生长因子、抗氧化剂抑制Bcl-2抗凋亡作用促进促凋亡基因作用增强P53促凋亡作用编辑课件㈡干预凋亡信号转导㈢调节凋亡相关基因㈣控制凋亡相关酶学机制㈤防止线粒体跨膜电位的下降编辑课件细胞凋亡的检测1、细胞凋亡的形态学及流式细胞术检测2、磷脂酰丝氨酸外翻分析〔AnnexinV法〕3、线粒体膜势能〔mt〕的检测4、DNA片断化检测5、TUNEL法6、Caspase-3活性的检测7、凋亡相关蛋白TFAR19的表达和细胞定位分析

编辑课件1、细胞凋亡的形态学检测

光学显微镜和倒置显微镜

未染色细胞：凋亡细胞V变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI。

电子显微镜观察编辑课件NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess〔488nm400〕编辑课件电镜观察凋亡细胞体积变小，胞质