化学品 嗜热四膜虫多代繁殖毒性试验 征求意见稿

1GB/TXXXXX—XXXX化学品嗜热四膜虫多代繁殖毒性试验本文件规定了化学品嗜热四膜虫（以下简称四膜虫）多代繁殖毒性试验的术语和定义、受试物信息、试验原理、参比物质、试验系统、限度试验、质量控制、数据统计的要求。本文件适用于评价可溶性化学品对嗜热四膜虫多代繁殖的影响。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T21845化学品水溶解度试验GB/T21852化学品分配系数（正辛醇-水）高效液相色谱法试验GB/T21853化学品分配系数（正辛醇-水）摇瓶法试验GB/T21855化学品与pH有关的水解作用试验GB/T27850化学品快速生物降解性通则GB/T21801化学品快速生物降解性呼吸计量法试验GB/T21802化学品快速生物降解性改进的MITI试验（I）GB/T21803化学品快速生物降解性DOC消减试验GB/T21831化学品快速生物降解性密闭瓶法试验GB/T21851化学品批平衡法检测吸附/解吸附试验GB/T21856化学品快速生物降解性二氧化碳产生试验GB/T21857化学品快速生物降解性改进的OECD筛选试验3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。种群密度populationdensity;PD单位体积（一般为mL）内四膜虫的个体数量。效应浓度effectconcentration;ECx在给定测定周期内，与对照组相比，导致四膜虫种群密度降低x%的受试物浓度。以每单位体积培养基所含的受试物量表示。最低可观察效应浓度lowestobservedeffectconcentration;LOEC在给定测定周期内，与对照组相比，在统计学意义上对四膜虫种群密度产生显著效应（P＜0.05）的最低受试物浓度。以每单位体积培养基所含的受试物量表示。2GB/TXXXXX—XXXXh)水解离常数(pka);生影响，因此短时间内可完成化学品多代毒性的危害评价工作。将2×10⁴cells/mL种群密度的嗜热四3GB/TXXXXX—XXXXc)超净工作台；d)全自动细胞计数仪(配备细胞计数板，测定体积为20μL);g)化学助溶剂(根据受试物溶解性选择，如二甲基亚砜、乙醇、丙酮等);h)CellCountingKit-8(CCK-8试剂盒);k)巴氏吸管(3mL,5mL,10mL);1)玻璃锥形瓶(100mL,1000mL);m)玻璃烧杯(500mL);n)无菌细胞培养板(24孔、96孔);本文件推荐的受试生物为嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)SB210株系繁殖旺盛期的(即未出现平台期降低、繁殖缓慢、尺寸减小等)四膜虫。应在相同的环境条件(培养基、温度、振摇速度和培养装置)下进行培养。若是刚复苏的四膜虫，需要在胰蛋白胨(SPP)培养基中孵4GB/TXXXXX—XXXX对受试物进行称重并溶解，可以通过超声、搅拌、涡旋或其他适合的物理方法协助配制贮备液。储备液的适宜浓度据受试物溶解度来确定，但一般不会超过1000μg/mL。低水溶性物质的贮备液可以通过低毒的有机溶剂来助溶，例如二甲亚砜、乙醇、丙酮等。7.4.2试验溶液的配置通过稀释受试物贮备液配制成一定浓度的试验溶液，推荐应用溶剂梯度稀释的方法配置不少于5个受试物试验浓度，以几何级数分布，浓度间隔系数不超过3.2，并做好标记。贮备液和试验溶液均用非培养基的溶剂进行配制，可在试验开始前进行提前制备，建议即用即配。预试验a）通过开展预试验以确定正式试验所需的受试物的浓度范围，可选择较大范围的浓度梯度，如以1：10的高稀释倍数选择预试验的试验浓度。预实验不设平行组，试验时间为18h。试验结束时统计各浓度的种群密度。根据预实验的结果，再以较小的稀释倍数进行正式试验。b）如果一次预试验结果无法确定正式试验所需的浓度范围，应调整受试物的浓度范围，再次进行预试验。正式试验程序7.6.1试验前的准备a）试验开始前的18h-24h，用新配置的SPP培养基对生长状况良好的四膜虫进行传代，接种密度为2.0×104cells/mL。传代完成后放回30℃恒温振荡器中，中速振摇（135r/min）维持稳定的生长和繁殖，并在暴露试验开始前检查其生长状态。b）四膜虫的繁殖模式十分规律，在上一次传代时应根据试验所需四膜虫数量确定传代体积，保证试验所用四膜虫数量满足统计学要求。c）各浓度梯度的试验溶液（非培养基溶解）均已配制完成，可直接用培养基进行稀释。推荐一次试验准备两种或四种受试物的试验溶液，即一次可进行2-4种受试物的毒性试验。d）提前准备无菌离心管（推荐使用小容量离心管：200μL，500μL），并做好标记，用于试验中的样品采集以及四膜虫的固定。7.6.2试验周期试验周期为18h。7.6.3接种与暴露a）用新鲜的SPP培养基将不同浓度的试验溶液进行稀释，同时准备溶剂对照试验组培养基，即在培养基中加入等体积的纯溶剂。含受试物的7组培养基和溶剂对照组培养基中的助溶剂终浓度应始终保持一致，并且不得超过100μL/L。当受试物水溶解度或在溶剂中的溶解度过低时，应增大试验体系的体积(例如10mL-100mL)，不再使用24孔板作为试验容器，改为使用三角瓶。此时不再使用贮备液稀释的方法制备试验溶液,直接使用SPP培养基在无菌条件下配制试验溶液。b）测定四膜虫初始种群密度后，用培养基将其制备成密度为2.0×104cells/mL的四膜虫培养液，使用移液器将准备好的八组四膜虫培养液均匀的依次加入24孔细胞培养板中，每孔1000μL，每个试验浓度设置三个平行孔，应同时设置空白对照组，若使用助溶剂，还应增设助溶剂对照组。（推荐24孔板，暴露方案设置参见附录C），此时计为0h。5GB/TXXXXX—XXXXc）如果条件允许，对照组平行数为处理组的2倍。如果试验需要得出最低观察效应浓度（LOEC）或无可观察效应浓度（NOEC），可适当增加平行数（如设置6个平行）并相应增加24孔板的个d）接种完成后将盖子放回原位，在培养板上标明接种时间和待测化学品名称，用封口膜对孔板对角的两角进行封口防止意外溅洒，重新置于恒温振荡器中培养，保持在黑暗条件下，温度设置7.6.4样品采集7.6.4.1采集频次本文件推荐1个采样时间点，为暴露后18h。7.6.4.2采集程序a）暴露18h后，从恒温振荡器中取出培养板，将四膜虫培养液轻柔的反复吹打混匀，从每孔各取140μL四膜虫培养液于无菌离心管中。b）吸取20μL采集的均一四膜虫培养液转入另一个提前加入20μL4%多聚甲醛的离心管中固定（四膜虫培养液：4%多聚甲醛=1：1），用于种群密度的检测。检测应在每次采样完成后立刻进行。7.6.5分析测定7.6.5.1受试物浓度测定试验前需要对受试物在SPP培养基中的稳定性进行验证；当受试物在暴露周期内（18h）可维持在初始或理论浓度的±20%范围内，试验结果使用理论浓度或初始浓度表示；当受试物在试验过程中因生物降解、水解、氧化等原因而无法维持在初始或理论浓度的±20%范围内时，应测定空白对照组、助溶剂对照组和所有受试物试验组在试验开始和试验结束时受试物的实际浓度，试验结果以实测浓度的时间-加权平均值或几何平均值表示。7.6.5.2四膜虫种群密度检测a）全自动细胞计数仪计数法：撕去计数板上下两层的保护膜，反复轻柔吹打以混匀固定的四膜虫培养液，吸取20μL进行加样。将需计数的一端插入进板口；选择提前设置好的明场细胞计数Assay类型（Assay参数设置见附录D），在主界面输入样品名称和稀释倍数；点击主界面左下角“Preview”，预览四膜虫图片，应符合细胞中心透亮，轮廓清晰且无聚团的要求。如不清晰，可适当调节焦距；拍摄图片并自动采集种群密度数据。b）当毒性效应导致四膜虫细胞密度过低时全自动细胞计数仪可能无法进行准确定量，此时建议使用细胞计数板在显微镜下进行人工计数，统计每个网格内的细胞数，最后计算出细胞密度。c）也可通过CCK-8试剂盒检测四膜虫的相对细胞活力，从而计算四膜虫的种群密度。吸取100μL均匀的四膜虫培养液加入至96孔细胞培养板中，并设置不含溶剂、受试物和四膜虫的培养基作为对照组（推荐96孔板设置见附录E）。每孔加入10μLCCK8试剂，将盖子放回原位，用封口膜对孔板对角线的两角进行封口以防止意外溅洒。30℃恒温培养箱中孵育3h后，用多功能微孔酶标仪于450nm波长下检测吸光度（OD值），以OD值和细胞密度作标准曲线，最后换算为四膜虫的种群密度。8限度试验6如果预试验结果显示，受试物在100mg/L的浓度下(或在试验溶液中的最大溶解度下，该溶解度大于100mg/L)对四膜虫没有产生任何可观察效应，可使用限度试验，限度试验的浓度为100mg/L,如果受试物在试验溶液中的最大溶解度大于100mg/L,则取该最大溶解度作为限度试验的浓度。限度试验设9质量控制9.1受试生物的质量控制9.2检测质量控制(阳性对照组)来检查试验质量。三氯卡班最大试验浓度可设置为4mg/L,暴露18h后，三氯卡班对四膜虫种群密度的EC₉₀值在0.5mg/L-0.9mg/L范膜虫种群密度的EC₄值在0.05mg/L-0.09mg/L范围内；氯化汞最大试验浓度可设置为4mg/L,暴露18以计算受试物暴露后24孔板中各孔种群密度的抑制率，用%表示，见式(1): P:处理组各平行四膜虫的种群密度。若种群密度抑制率与受试物浓度呈剂量-效应关系，应采用适宜的数据(或经转换后的数据)服从正态分布且方差齐性，采用多重t检验(multiplet-tests)统计学方法，7GB/TXXXXX—XXXX和NOEC。。如果数据不服从正态分布或方差齐性时，则采用非参数检验方法，如Dunn’s检验或Bonferroni-U检验。当数据方差不齐但符合单变量剂量-效应关系时，可使用其他非参数检验（如Jonckheere-Terpstra趋势检验或Shirley检验）。试验报告试验报告应至少包含以下内容：a）受试物和参比物——单一组分受试物，化学名称、IUPAC名称或CAS名称、CAS号、SMILES或InChI编码、结构式、水溶解度及相关的物理化学特性、纯度、其它杂质的信息和任何其它可获得的信息（包括有机碳的含量，如适用）等；——多组分受试物，UVCB物质和混合物：获得尽可能多的各成分的组成比例和物理化学性质；——用来鉴别和定量测试受试物的分析方法。b）受试生物——品系、分类名、代际信息、来源和培养条件。c）试验条件——采用的试验程序（接种密度、孔板信息等）；——培养温度和振荡器转速信息；——试验设计（试验浓度及重复的数量等）；——受试物的预处理方法和添加回收率；——试验浓度的理论值，浓度分析样品的采集和获得的浓度测定数值的详细信息；——培养基的详细信息（培养基的组分、PH等）。d）试验结果——与受试物稳定性相关的任何预试验结果；——试验结束时各组每个平行孔中四膜虫的种群密度的完整记录；——若适用，应报告受试物对四膜虫种群密度的最低可观察效应浓度（LOEC）和无可观察效应浓度（NPEC包括采用的统计学方法的描述和预判毒性效应范围的证据（为了证明这一点，在开始试验前进行全面的分析）；若适用，四膜虫种群密度的ECx和置信区间（如95%）和用于计算的合适模型曲线；浓度-效应方程和置信区间；——其它可观察或测定的生物学效应：记录任何其它可观察或测定的生物学效应（如四膜虫的异常行为；游动速率；形态变化等），并加以合理解释。e）结果讨论——可能影响结果的因素。f）解释说明——对试验中出现的任何偏离需说明偏离及对试验结果的影响。8GB/TXXXXX—XXXX（资料性）四膜虫时间-繁殖代际参考表在24孔板中，以2×104cells/mL的初始种群密度开始繁衍，四膜虫种群数量和繁殖代际随时间的变化参考表A.1。表A.1培养至不同时间点四膜虫的种群数量和繁殖代际密度(×10cells/mL）99GB/TXXXXX—XXXX（规范性）四膜虫的实验室维护及培养方法实施指南B.1介绍嗜热四膜虫（TetrahymenaThermophila）是一种单细胞真核生物，分布在全球的淡水水域中。其外观呈椭圆长梨状，体长约50μm，全身布满数百根长约4μm—6μm长的纤毛，纤毛排列成数十条纵列,以摄取水中的细菌与其他有机质维生。在实验室培养条件下，四膜虫在培养基中无菌培养即可良好的生长，操作方便。它以二分裂的方式进行生殖，周期短，大约数小时可繁殖一代，在24h内可完成约9-10代际的繁殖，培养过程中能够迅速达到指数增长期，是生长最快的真核生物之一。相比于其他水生生物，嗜热四膜虫对水体中外源性污染物的毒性具有较高的敏感性，是探究水环境污染的理想指示生物。需要注意，为确保试验结果的准确性，应在标准条件下进行四膜虫的维护和培养。如使用的所有介质均应使用超纯水配置。所用玻璃器皿建议用手工清洗，清洗后用去离子水反复仔细冲洗，在干燥前应将玻璃器皿中的水倒排干净。此外，为了防止污染，与四膜虫接触的所有物品均需提前进行灭菌处理，所有操作建议在无菌条件下完成。B.2常用培养基a）大豆培养基将1整粒黄豆（或鹰嘴豆）和10mL去离子水加入带旋盖培养试管中，高压灭菌冷却后加入青霉素和链霉素（250μg/mL）以及两性霉素B（0.25μg/mL）。若培养基在24h内出现浑浊或蒸发现象则不能使用。b）Tris缓冲液（10mmol/L）将1.22gTris溶解于1L去离子水中，高压灭菌冷却后，调节pH至7.5，4℃保存备用。c）SPP培养基将10g蛋白胨、1g葡萄糖、0.5g酵母浸粉和0.015g铁钠盐溶于1L去离子水中，经121℃高压灭菌30min，冷却后加入青霉素和链霉素（250μg/mL）以及两性霉素B（0.25μg/mL），调节溶液的PH值至7.0，4℃保存备用。B.3四膜虫的保种B.3.1四膜虫的冻存四膜虫的冻存操作步骤如下：a）四膜虫的收集：收集处于对数生长期（种群密度范围为1.5×105cells/mL-2×105cells/mL培养液）的四膜虫培养液100mL，转移至无菌的Tris缓冲液中室温离心（3000r/min）2min，弃上清，再重复离心清洗一次后，用Tris缓冲液重悬至100mL。b）饥饿处理：将100mL四膜虫培养液转移至1L的无菌锥形瓶中（或两个500mL锥形瓶，每瓶50mL四膜虫培养液），封口后在30℃条件下静止孵育2-3天。由于饥饿培养过程不进行振摇，因此选用大锥形瓶来保证充足的曝气。c）冻存：将四膜虫培养液在室温条件下离心（3000r/min）2min后去除上清液，将原始体积（100mL）浓缩至1mL，并添加0.4mLDMSO（细胞级）和3.6mLTris缓冲液。轻柔吹打混匀四膜虫悬液，分装至多个冻存管中，每个冻存管保存0.3mL，做好日期标记后置于-80℃条件下保存12h后转至液氮中长期保存。GB/TXXXXX—XXXXB.3.2四膜虫的复苏四膜虫的复苏操作步骤如下：a）将水浴锅和SPP培养基提前预热至42℃,从液氮中取出冻存管，先在水浴锅中解冻15s，再加入1mLSPP培养基，再轻柔放于水浴锅中继续解冻。b）待完全融化成液体后，将四膜虫培养液转至含有10mLSPP培养基的100mL锥形瓶中培养，用无菌透气封口膜封口，橡皮筋固定。c）将锥形瓶放入30℃恒温振荡器中，维持中速振摇（135r/min）培养，并观察其长势，约24h-48h可进行复苏后的第一次传代。B.4四膜虫的培养B.4.1长期储存培养在不经常使用营养细胞、无法进行液氮保种时或需要进行长途运输时，可用此方法维持四膜虫的生存能力达数月之久。操作如下：a）将少许健康细胞转入大豆培养基中。b）加入1ml-2mL无菌石蜡油防止蒸发，轻轻盖上悬帽。c）15℃-20℃静止培养。注：不建议用此方法进行保种，虽然此方法可以保存四膜虫长达半年B.4.2快速营养繁殖四膜虫在各种无菌培养容器中均可传代培养，通常使用培养瓶或细胞培养板，使用的初始种群密度应超过0.25×104cells/mL培养液，在30℃下进行中速振摇（135r/min），即可刺激其进行最大限度的营养繁殖。B.4.3传代培养a）每24h-48h将1%-2%体积比的四膜虫转入新鲜的SPP培养基中进行非实验条件下的常规传代培养；b）在试验条件下，需先确定种群密度，然后用新鲜的SPP培养基制成2×104cells/mL的四膜虫培养液进行培养。注1：培养装置需维持充足的给氧空间，至少占培养注2：不能持续保持细胞指数增长，以防产生生长速率降低的无性系和端天（如，定在周末）不传代的方法来恢复其生长的稳定性，或定注4：条件允许的情况下，尽量每天检查四膜虫的游动状态和种群密度以判断其健康情况。健康的四膜虫在未受到ABCDGB/TXXXXX—XXXXABCD（资料性）四膜虫暴露试验24孔板设置推荐方案在24孔板中，对一种受试物可使用如下所示的暴露方案进行试验:GB/TXXXXX—XXXX（资料性）四膜虫种群密度检测相关参数设置推荐方案全自动细胞计数仪明场模块下四膜虫识别参数设置推荐如下：MinSize：20，MaxSize：GB/TXXXXX—XXXXABCDEFGH（资料性）四膜虫相对种群活力检测96孔板设置推荐方案在96孔板中，对两种受试物可使用如下所示设置方案进行相对种群活力检测：bbbbbbbbbbbbbMCSC浓浓浓浓浓浓浓bbMCSC度度度度度度度bbMCSC1234567bbMCSC浓浓浓浓浓浓浓bbMCSC度度度度度度度bbMCSC1234567bbbbbbbbbbbbbb表示空白孔。为防止蒸发效应，每孔加入等体积的SPP培养基；MC表示培养基对照组；SC表示溶剂对照组；第4列至第10列分别为从高到低7个试验浓度的四膜虫培养液；每个96孔板可检测两种受试物，如B-D行检测受试物1，E-G行检测受试物2。GB/TXXXXX—XXXX参考文献[1]GerhardtA,Ud-DaulaA,SchrammKW.Tetrahymenaspp.(Protista,Ciliophora)astestspeciesinrapidmultilevelecotoxicitytests.ActaProtozool,2015,49:271-280[2]Cassidy-HanleyDM.Tetrahymenainthelaboratory:strainresources,methodsforculture,maintenance,andstorage.MethodsCellBiol,2012,109:237-27[3]HaoH,YuanSL,ChengSY,SunQ,GiesyJP,LiuCS.Effectsoftris(2-chloroethyl)phosphate(TCEP)ongrowth,reproductionandgenetranscriptionintheprotozoanTetrahymenathermophila.AquatToxicol,2020,222:105477[4]LiJ,GiesyJP,YuLQ,LiGY,LiuCS.EffectsofTris(1,3-dichloro-2-propyl)Phosphate(TDCPP)inTetrahymenaThermophila:TargetingtheRibosome.SciRep,2015,5:10562[5]LiJ,MaXF,SuGY,GiesyJP,XiaoY,ZhouBS,LetcherRJ,LiuCS.Multigenerationaleffectsoftris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphateonthefree-livingciliateprotozoaTetrahymenathermophilaexposedtoenvironmentallyrelevantconcentrationsandaftersubsequentrecovery.Environpollut,2016,218:50-58[6]ChengSY,LiuH,SunQ,KongR,LetcherRJ,LiuCS.Occurrenceofthefungusmycotoxin,ustiloxinA,insurfacewatersofpad