中国汉族人食管鳞状细胞癌易感基因定位研究课件

中国汉族人食管鳞状细胞癌

易感基因定位研究

周福有王立东

河南省安阳市肿瘤医院胸外科河南省食管癌重点开放实验室2010.10.31郑州河南省林县、安阳、新乡等显著的地域分布差异

食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一，每年死亡30万人，也是中国最常见的恶性肿瘤，排在中国恶性肿瘤死因的第四位有显著的地域分布特征，高低发区发病率相差高达500倍杨氏家族家庭成员:23,食管癌患者:15(65%)明显的家族聚集现象高癌家族林县1965年高癌家族林县2007年环境因素复杂遗传因素明显食管癌的病因尚不清楚

遗传因素？

环境因素？问题：遗传因素和环境因素究竟孰重孰轻？相互之间如何起作用？单基因遗传病单基因遗传病是指单一基因突变引起的疾病符合孟德尔遗传方式，所以称孟德尔式遗传病多基因遗传病多基因遗传病是由多个微效基因与环境因素共同作用所致,遗传方式不遵循孟德尔遗传模式癌症

糖尿病

高血压

冠心病

精神分裂症

……2003年1953年遗传学研究的三大里程碑

人类基因组研究第一次浪潮

2005年多国参与的合作项目构建不同人群的高密度SNP图谱确立SNP在人群中的常见分布和传递模式每1000个碱基对中有1个SNP,个体遗传信息有99.9%是相同，差异0.1%。发现与这些差异可以了解常见疾病相关基因为揭示人类的遗传机制，发现常见疾病相关基因提供方向；为发现复杂疾病易感基因提供基础数据、研究策略和先进技术人类基因组单体型图计划（HapMap计划）

GWAS基于“常见疾病，常见突变”学说，通过整个人类基因组来寻找常见遗传变异的可见性状间关系的研究方法全基因组关联分析(GWAS)?GWAS原理

ATGCAAGCTGATCGATCGATCGCGACCATGCAGCACCTGACTGCATGCAAGCTGTTCGATCGATCGCGACCATGCAGCACCTGACTGC病例对照原理：在一定人群中，某个等位基因或基因型在病例和对照组中存在差异，说明它与疾病有关联性病例对照

在病例中等位基因C的频率明显高于对照提示：等位基因C与疾病存在一定关联性55%35%45%65%30.25%12.25%20.25%42.25%45.5%49.5%GWAS举例

全基因组关联分析GenomewideassociationstudyGWAS优势GWAS癌症研究(NG,2008-)已完成或正进行：乳腺、前列腺、肺、结直肠癌、黑色素瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、胰腺、膀胱、肾脏、卵巢癌和造血系统肿瘤等食管癌：日本1篇小样本文章尚无中国汉族人食管癌GWAS资料“863”计划将对威胁我国人口健康的5类常见重大疾病：精神疾病、高血压、糖尿病、食管癌和肺癌进行全基因组关联分析研究。选择tagSNPs标记单体型在病例-对照人群间比较SNPs等位基因频率全基因组关联统计分析，得出有意义的SNPs另外选择独立的病例-对照人群对初筛阶段的结果进行验证GWAS技术路线HapMap计划初筛阶段重复验证阶段利用芯片对所有tagSNPs进行基因分型研究对象中国汉族人群全部21496例初筛2810例（病例1077例/对照1733例）

验证18686例（病例7673例/对照11013例）入组标准资料详实完整病例/对照为同一地区自愿参加病例组无治疗史病例组病理证实食管癌分期按UICC2007标准对照组三代亲属中无食管癌病例对照组经内镜检查除外早期食管癌不符合以上标准予以除外资料及血样收集

45家医院：全国范围，华北为主问卷调查：统一格式采集外周静脉血食管癌GWAS合作研究研讨会2009.4.5-6安阳DNA提取及标化

QIAGEN（德国）基因组DNA提取试剂盒按标准程序提取每份血样的DNA准确测定每份待标化DNA的浓度初筛浓度：50ng/μl，OD值1.8-2.0

验证浓度：15ng-20ng/μl，OD值1.7-2.0基因分型和质控

初筛：IlluminaHuman610-Quad芯片验证：SequenomiPLEX

芯片具体步骤：（6）清洁芯片（7）染色（8）芯片扫描（9）数据质控（1）制备MSA1板（2）片段化（3）沉淀（4）重悬（5）杂交优势技术：综合了BeadArray高密度微阵列技术和GoldenGate多通道位点特异性延伸扩增检测方案通量：一次分型的SNP位点达到55万－60万,同时可以定制自己感兴趣的位点Illumina分型芯片统计学分析数据质控：计算样本得率、SNP得率、最小等位基因频率、哈迪·温伯格遗传平衡吻合度检验对质控后的数据用Plink1.03软件分析Cochran-Armitage趋势检验：计算P值、优势比（OR）和95%可信区间（95%CI）初筛

50万个SNPS

病例1077

病例937对照1733

对照692趋势检验

进入初筛去除不匹配者

80个SNPS

18个SNPS

2个SNPS

全基因组曼哈顿图

（937病例/692对照）选点选点18个SNPS2个SNPS

病例7673例/对照11013例

rs2274223rs13042395验证研究了在目标SNP和基因位点处相关区域的重组和链锁不平衡类型两个易感基因分别定位

phospholipaseCepsilon1(PLCE1),10q23

chromosome20openingreadingframe54(C20orf54),20p13基因定位两个易感基因和肿瘤密切相关PLCE1（磷脂酶基因亚运型）对多种恶性肿瘤的发生、发展、转移有促进作用C20orf54（核黄素转运基因）调节人类核黄素的转运，而核黄素缺乏是增加食管鳞状细胞癌发生的重要风险因子PLCE1蛋白表达在不同病变组织差异显著0102030405060708090正常组织食管鳞癌癌前病变%P=2.08E-13阳性阴性结果提示免疫组化发现随食管癌变过程的进展，即正常→癌前病变→浸润癌各级组织中PLCE1蛋白阳性表达率逐渐升高

进一步提示：PLCE1的遗传变异在食管癌变过程中起重要作用，PLCE1可能是中国汉族人食管鳞状细胞癌的致病基因食管癌变各阶段免疫组化染色DYSNORCISSCC王立东，周福有，等ADH1B位于4q21-23ALDH2位于12q24两个基因都与酒精代谢有关日本食管鳞癌GWAS结果增加食管鳞癌发病风险下一步工作计划增加样本量，再筛出几个易感基因将所发现的易感基因在世界各地样品进行验证，找出种族差异进行现场研究，用于食管癌早筛相关功能研究，靶向药物的研制GWAS临床应用GWAS重复验证明确基因和基因产物确定功能开发基因靶向治疗药物开展个体化治疗开发诊