生物化学实验技术

生物化学实验技术生物化学实验技术实验一、双缩脲法测定蛋白质含量实验二、紫外分光光度法测定蛋白质含量实验三、血清γ-球蛋白的分别与纯化实验四、碱性磷酸酶Km值测定实验五、胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响实验六、血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析实验七、SGPT活性测定实验八、聚丙烯酰胺凝胶电泳分别血清LDH同工酶实验九、RNA的分别与鉴定实验十、DEAE纤维素离子交换层析法分别蛋白质实验十一、质粒的提取与鉴定实验一双缩脲法测定蛋白质含量【目的要求】掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理。【实验器材】中试管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计【方法步骤】取中试管3支，按下表操作。试剂（ml）标准管样品管空白管蛋白质标准待测液蒸馏水双缩脲试剂0.1————5.0

——0.1——5.0

————0.15.0各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。【本卷须知】1．正确运用微量加样器。2．取液要准确。3.做好标志，不要将试管号弄混。【思索题】1．分光光度计的运用及计算原理。实验二紫外分光光度法测定蛋白质含量【目的要求】①了解分光光度法的根本原理；②能较熟练运用紫外分光光度计。【实验器材】1．紫外分光光度计。2．微量加样器。3．蛋白规范液〔1mg/ml〕。【方法步骤】1．规范蛋白质溶液：任选一种蛋白质溶液，经凯氏定氮法测定蛋白质的含量后，用生理盐水稀释成浓度为1mg/ml的蛋白质溶液。2．规范曲线的制造：取试管6只，按下表操作管号123456蛋白标准液（ml）

生理盐水（ml）

0.53.51.03.01.52.52.02.02.51.54.0混匀，以第六管调零点，280nm波优点比色。用光径为1cm的石英杯测定各管吸光度，以各管的吸光度值为纵坐标，计算各管内蛋白质的浓度，以蛋白质的浓度为横坐标绘制规范曲线。3．标本测定：用生理盐水将待测蛋白质样品稀释成大约1mg/ml溶液。取1.0ml样加生理盐水3.0ml混匀，按上述方法测其吸光度。【结果与分析】1．根据规范曲线查出蛋白质浓度。2．也可利用阅历公式计算蛋白质含量；适当稀释蛋白质溶液测其A280nm和A260nm处吸光度，再用阅历公式直接计算蛋白质浓度。如Lowry-Kalckar公式：蛋白质浓度〔mg/ml〕＝1.45A280－0.74A260。【本卷须知】1．加量要准确。2．比色皿的正确运用。3．结果反复3次，取平均值。【思索题】1．为何要同时测定蛋白280nm和260nm处的光吸收值？〔一〕血清γ-球蛋白的分别与纯化实验三1．

掌握蛋白质分别纯化的主要方法和原理；

2．熟习盐析和层析的根本操作；

3．掌握离心机的正确运用方法。【实验目的】【仪器试剂】试管、刻度吸管、吸耳球、胶头滴管、层析柱、反响板；血清、PBS液、葡聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、饱和硫酸铵溶液。【实验原理】1.盐析：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。〔1〕蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的要素①电荷(同种电荷相斥〕②水化膜〔隔离〕Pr++++++Pr++++++中性盐破坏了这两个稳定性要素，使蛋白质沉淀。中性盐参与蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消逝。同时，中性盐参与蛋白质溶液后，由于离子强度发生改动，蛋白质外表电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。沉淀蛋白质的方法还有哪些？〔2〕盐析的影响要素蛋白质的浓度、盐浓度、pH值、温度等。本实验球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀而清蛋白溶解，γ-球蛋白在33%浓度的硫酸铵溶液中沉淀。2.层析：待分别蛋白质溶液〔流动相〕经过一个固态物质〔固定相〕时，根据溶液中待分别的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分别的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而到达分别蛋白质的目的。3.检测分别效果〔1〕纳氏试剂：盐存在时，NH4+与其反响呈现黄色或橙色。〔2〕双缩尿试剂检测：蛋白质与其呈现红色或紫红色。1．盐析⑴血清2ml放入离心管中，参与PBS2ml混匀逐滴参与饱和硫酸铵溶液4ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3000rpm10分钟，倾上清液〔上清中主要含清蛋白〕。【实验操作】⑵将离心管中的沉淀用1mlPBS搅拌溶解，再逐滴参与饱和硫酸铵溶液0.5ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3000rpm10分钟〔留意离心机运用时需求配平并且离心时将盖子盖好〕。倾上清液〔上清中主要含α、β球蛋白〕，沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白。⑴装柱：将制好的葡聚糖凝胶混匀，倾入层析柱内，静止后分层，凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间。当液面接近凝胶上外表时将出口胶管夹紧待用。2.脱盐：留意：装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整〔2〕加样：向装有γ-球蛋白的离心管内参与PBS10滴，用玻璃棒搅拌使之溶解。再用乳头吸管吸出γ-球蛋白液，加到层析柱内凝胶外表。待γ-球蛋白液全部进入凝胶柱内时，再用乳头吸管小心参与PBS约1cm高，待大部分液体进入凝胶柱后，再继续加PBS直至洗脱终了〔加液时留意不要冲击凝胶外表〕。在整个洗脱过程中不能让液面降至凝胶面以下。〔3〕搜集：加样同时可进展搜集，每管搜集1ml。搜集12管后加紧螺旋夹。回收凝胶和尼龙布等。⑷检测：预备反响板两块。将12管搜集液各取1滴分别放入反响板的12个凹孔。一块板的各孔内加纳氏试剂1滴，有NH4+者呈黄色至橙色。可用＋、－号表示有无呈色或颜色深浅。再向另一块板的各孔内加双缩脲试剂1滴，有蛋白者呈蓝紫色。【实验结果】可用＋、－号表示有无呈色或颜色深浅。将双色脲反响呈色最深的一管搜集液保管供下次实验运用。利用醋酸纤维素薄膜电泳检测本次实验所提γ-球蛋白的纯度。1．

运用离心机前留意配平；2．

装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整；3．凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间；4．脱盐时不能冲击凝胶面，PBS液面不能降到凝胶面以下；5．实验后将凝胶中盐洗脱干净后回收再利用。【实验本卷须知】【思索题】1.装柱不均匀，凝胶面不平整对实验结果有什么影响？2.盐析与变性的异同？3．凝胶层析的原理？〔二〕血清γ-蛋白的鉴定——醋酸纤维素薄膜电泳1.掌握电泳的根本原理；

2.熟习醋酸纤维素薄膜电泳的方法和

运用。

【实验目的】【仪器试剂】电泳仪、点样器、镊子、醋酸纤维素薄膜；巴比妥缓冲液、染色液、漂洗掖。【实验原理】1.蛋白质是两性电解质，在同一个PH环境下，混合蛋白质中各种成分带电量不同、分子大小不同，在同一电场中泳动的速度不同，导致一样的时间迁移的间隔不同而把它们分开。〔1〕分子越小，泳动速度越快〔2〕带电量越多，泳动速度越快反之，越慢。2.本实验分别全血清中各种蛋白质成分，同时鉴定上次实验提纯结果。

♁点样γβα2α1清蛋白

♁Γ球蛋白1.预备与点样：用巴比妥缓冲液将醋酸纤维素薄膜充分浸透，在毛面距一端1.5厘米处点样，即上述实验得到的γ-蛋白，另取薄膜一点全血清。2.电泳：点样面朝下，点样端接近负极，电压110V，通电40-45min；3．染色：2-5min；4.脱色：直至背景漂净为止。【实验操作】【实验结果】根据电泳区带出现的位置和条数判别是何种血清蛋白，假设只是一条γ-蛋白阐明上个实验分别纯化的较好。1．不要用手触摸纤维素膜；2．留意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛面；3．点样位置要在1.5厘米以内，不要距边缘太近，不要反复点样；4．膜放进电泳槽时，将点样面向下，点样端接近阴极；【实验本卷须知】【思索题】假设电泳结果证明γ球蛋白的分别效果不理想，应从哪些方面分析？实验四

碱性磷酸酶Km值测定【目的要求】①了解酶促反响的影响要素；②掌握Km的意义和测定方法；③了解底物浓度与酶活性的关系。【实验器材】1．可见分光光度计。2．微量加样器。3．0.025U/ml的酶液。【方法步骤】1．取干净试管8支，按下表正确操作：试剂123456780.02M基质液蒸馏水碳酸盐缓冲液

0.11.31.50.21.21.50.31.11.50.41.01.50.60.81.50.80.61.51.41.51.41.5混匀置37℃水浴保温5分钟酚标准液

酶液0.10.10.10.10.10.10.10.1充分混匀置37℃水浴准确保温15分钟0.5％铁氰化钾

2.02.02.02.02.02.02.02.0充分混匀后置室温10min，510nm波长下进展比色，以第8管做空白，测定各管的光密度。【结果与分析】1．计算各管酶活性单位。D测/D标×0.012．计算各管[S]。[S]＝参与[S]量/3.0×0.023．进一步计算出各管1/V和1/[S]。4．将上述数据填入下表数值1号2号3号4号5号6号光密度值V1/V[S]1/[S]以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标，画出各管的坐标点，并将其连成直线，此直线与横轴的相交点为-1/Km，由此可计算出该酶的Km。【本卷须知】1．本实验所用各种玻璃仪器必需洗净烤干后备用。2．各种试剂的参与量要准确。3．严厉掌握参与酶液后的保温时间，否那么会影响其产物量的准确度【思索题】1．为何可以酶活性单位代表酶促反响速度？2．酶促反响的影响要素有哪些？3．何为Km值？如何测定一个酶的Km值？—Folin-Wu法实验五

胰岛素和肾上腺素对血糖

含量的影响

1.掌握影响血糖含量的要素；

2.熟习测定血糖的原理和方法及临床意义；

3.熟习动物取血的根本操作。【实验目的】

【仪器试剂】722型可见光分光光度计、血糖管、奥氏吸管、锥形瓶、注射器等；钨酸钠、浓硫酸、磷钼酸、碱性铜等。用于吸抗凝血,中间为膨大的球体,减少血液和吸管壁的接触面积,尽量防止融血.【实验原理】主要调理激素降低血糖：胰岛素升高血糖：胰高血糖素(glucagon)、糖皮质激素、肾上腺素1.体内血糖程度主要依托激素的调理胰岛素(insulin)：体内独一降低血糖程度的激素肾上腺素：主要在应激形状下发扬调理作用。2.无蛋白血滤液的制备原理本实验采用吴宪氏法测定血糖，要求将血液制成无蛋白血滤液：???2RCOOHNH2+H2WO4RCOOHNH2WO42此方法是生物碱沉淀蛋白质沉淀蛋白质的方法还有哪些？3.利用吴宪氏法测定血糖的原理G+Cu2+△OH-Cu2O+糖氧化物3Cu2O+3H3PO4.2MO3.12H2O6CuO+3H3PO4.2MO2O3.12H2O钼蓝经过测定钼蓝颜色的深浅计算葡萄糖的含量！1．动物预备取正常家兔两只，实验前预先饥饿，称体重〔普通为2～3kg〕。2．取血以耳缘静脉取血，先去毛，用二甲苯擦拭兔耳，使其血管充血，再用干棉球擦干，用粗针头刺破静脉放血，将血液收入抗凝管中〔按10：1的比例将防凝剂放入试管，边搜集〔量约3ml〕边摇匀，以防凝固。用干棉球压迫血管止血。【实验操作】3．注射激素后取血(1)取饿兔血后，其中一只兔腹部皮下注射胰岛素，剂量按0.75u/kg体重计算，并记录注射时间。一小时后再取血。取血后立刻腹腔或皮下注射25%葡萄糖液10ml，以免家兔发生胰岛素性休克而死亡。(2)另一只兔腹部皮下注射肾上腺素，剂量按0.4mg/kg体重计算，并记录注射时间。半小时后再取血。用枯燥的奥氏吸管吸防凝血1ml，擦去管尖外面的血液后，渐渐地放于枯燥的锥形瓶中,然后吸硫酸8ml,渐渐地参与，随加随摇〔不能有气泡产生〕，此时溶液逐渐变为深棕色，再沿锥形瓶壁参与钨酸钠1ml，随加随摇以充分沉淀蛋白质，混匀后，放置5分钟，然后以2500rpm离心5分钟，倒出上清夜待血糖测定用，此液即无蛋白血滤液。4.无蛋白血滤液的制备：5.血糖值的测定取中试管五支，分别标志，按下表操作

试剂空白管规范管胰前胰后肾前肾后

无蛋白血滤液0.50.50.50.5G规范液0.5蒸馏水0.5碱性铜0.50.50.50.50.50.5混匀，置沸水浴中煮8分钟，取出，放入冷水浴中冷却。切勿摇动血糖管。各参与磷钼酸试剂0.5ml，混匀，放置10分钟，各加蒸馏水5ml，用420nm波长比色，以空白调零，读取各管光密度.【实验结果计算】葡萄糖〔mmol/L〕=OD测定/OD规范×0.5×10正常值：3.9～6.1mmol/L〔人〕

兔比人略低。C规范稀释的倍数1.制备无蛋白血滤液过程中，用奥氏吸管汲取全血，将吸管外壁的血液擦除干净后插入蒸馏水底层，渐渐放出血液，再用上层液将内壁的血液冲洗干净。2.加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀。3.沸水浴和冷水浴过程中，切勿摇动。

【实验本卷须知】【思索题】1.为什么测定血糖时必需预先出去蛋白质？2.为什么选用奥氏吸管汲取血液？3.为什么用操作中不要摇动血糖管？胰岛素①促进葡萄糖转运进入肝外细胞；②加速糖原合成，抑制糖原分解；③加快糖的有氧氧化；④抑制肝内糖异生；⑤减少脂肪发动。——体内独一降低血糖程度的激素胰岛素的作用机制:实验六血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析【目的要求】1.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。2.掌握血浆脂蛋白的分类。【实验器材】1.仪器与资料：玻璃片，5ml刻度吸量管，滤纸片，打槽器，20μl微量加样器，电泳仪。2．试剂：苏丹黑B染色液，巴比妥缓冲液，凝胶缓冲液，琼脂糖凝胶。3．样品：血清【方法与步骤】1.制板:取玻璃片放到平整的桌面上，用刻度吸量管汲取溶化的琼脂糖约2.5～2.8ml加到玻璃片上。2.挖槽：5分钟后，在离凝胶板一端约1.5厘米处打一个10×1mm的小槽，用压扁的针头将槽内凝胶去除，然后用滤纸片将槽内的水吸干。【方法与步骤】3.加样:于琼脂糖凝胶槽内参与预染好的血清20μl。4.电泳:将加好样品的琼脂糖凝胶板置于电泳槽支架上，样品端接近阴极，再用双层纱布搭桥，平衡3～5分钟，然后通电，电压为80～100v，电泳时间为40～60分钟。【结果与分析】α-脂蛋白位于最前，β-脂蛋白位于最后，中间为前β-脂蛋白，空腹血清无乳糜微粒，进食后血清可出现乳糜微粒位于原点。【本卷须知】1.制板要均匀。2.挖槽要整齐,不能太宽。3.电泳电压要坚持稳定。【思索题】1.琼脂糖凝胶电泳的原理是什么？实验七SGPT活性测定【目的要求】１．掌握SGPT活性测定的原理。２．熟习SGPT活性测定的临床意义。【实验器材】1．仪器与资料:中试管3支，l毫升刻度吸管2支，5升刻度吸管1支，100μl微量加样器，水浴箱，721型分光光度计。2．试剂:丙酮酸规范液，SGPT基质液，0.1MpH7.4磷酸盐缓冲液，2、4-二硝基苯肼溶液，0.4mol/LnaOH溶液。3．样品:血清【方法与步骤】取中试管3支，按下表操作。

规范管样品管空白管血清〔ml〕0.10.1丙酮酸规范液〔ml〕0.1SGPT基质液〔ml〕0.50.5

混匀后，37℃水浴箱30分钟，【方法与步骤】规范管样品管空白管2、4-二硝基苯肼〔ml〕0.50.50.5SGPT基质液〔ml〕0.5

混匀后，37℃水浴箱30分钟，0.4mol/LNaOH〔ml〕5.05.05.0【方法与步骤】将各管混匀后静置10分钟，然后用721型分光光度计500nm波长比色，以空白管调零，读取光密度值，计算。SGPT=测定管光密度规范管光密度×20×2.50.1×11【结果与分析】正常值为2-40单位注：1个SGPT单位相当于1ml血清37℃，30分钟产生2.5ug丙酮酸。【本卷须知】1．试剂量、保温时间要准确。2．测定时间尽量短。【思索题】1．SGPT测定有何临床意义?聚丙烯酰胺凝胶电泳分别血清LDH同工酶

实验八【目的要求】掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的根本原理。学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，用于分别蛋白质。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N—tetramethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状构造的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。【实验原理】聚丙烯酰胺凝胶有以下特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分别物不起化学反响，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只需Acr纯度高，操作条件一致，那么样品分别反复性好；(5)样品不易分散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调理，根据被分别物的分子量选择适宜的浓度，经过改动单体及交联剂的浓度调理凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不延续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因此较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度(T)的选择与被分别物质分子量亲密相关。表3.4分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋白质104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 5×105 2-5 核酸(RNA) 104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为延续系统与不延续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全一样。图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳表示图

(A为正面,B为剖面)

乳酸脱氢酶〔LDH〕是葡萄糖酵解过程中很重要的一种酶，该酶催化丙酮酸和乳酸的相互转化。LDH目前发现有五种同工酶。在碱性条件下，五种LDH同工酶都带负电荷，电泳时都向正极挪动。由于各种同工酶的pI不同，在同一pH条件下带电荷多少不同，电泳速度即不同，故可用电泳法将其分别。按电泳速度的快慢依次为ODLDH1、ODLDH2、ODLDH3、ODLDH4、ODLDH5将LDH同工酶电泳分别后进展染色，以显示各种同工酶的位置。其染色的原理是：乳酸丙酮酸NAD+NADH+H+PMSH2PMSNBT(无色)NBTH2(紫蓝色)【实验器材】仪器与资料真空泵、圆盘电泳槽、电泳仪、刻度吸管、微量加样器、长头注射器、烧杯等。试剂30％丙烯酰胺储存液、催化剂1％过硫酸铵、1％TEMED缓冲液、电泳槽缓冲液、蔗糖、乳酸钠、辅酶I、PMS、NBT、7.5%醋酸溶液样品血清【方法与步骤】1.预备玻璃管：预备5×60mm玻璃管假设干支，洗净烤干，管下端套一密塞的橡皮套或瓶塞，垂直插入管架上。试剂用量TEMED缓冲液30%Acr-Bis溶液蒸馏水1.5ml4ml6ml混匀真空抽气5分钟0.14%过硫酸铵合计6ml17.5ml2.配制凝胶：3.装管：用细长滴管或长头注射器汲取凝胶装入玻璃管中，高度间隔管上口8mm为宜，检查管内无气泡后，向胶面渐渐注入蒸馏水约4mm高度，在自然光下聚合约40分钟，见水与胶之间有明显界面出现，为胶已聚合。用滤纸条汲取凝胶上方水层，取下管底部的橡皮套管，将凝胶管垂直插入电泳槽圆孔中并尽量使各管高度一致。4.加样：用微量加样器每管加血清―蔗糖稀释液100ul，〔血清1份，40%蔗糖6份，溴酚兰少许混合而成〕。用电极缓冲液将胶管顶端注满，小心防止样品混合。在上下槽中参与电极缓冲液，上槽应漫过胶管上口。5.电泳：接通电源，负极接上槽，正极接下槽，调电流2.5mA/管或调电压200V，坚持电压稳定。等染料迁移到距凝胶下口约5mm处时，停顿电泳。时间约2小时。6.出胶：用长头注射器吸满水，将针头小心插入凝胶与玻管壁之间，边推水边旋转胶管，凝胶柱即可脱出。将每条胶柱放入小试管内。7.染色：管内加染色液，放37℃水浴保温待淡紫色区带出现〔约30分钟〕。倒出染色液并用水洗去凝胶柱外表染色液，参与醋酸溶液以终止酶促反响。8.百分含量扫描测：将分别的LDH同工酶凝胶柱用薄层层析扫描仪在560nm波优点扫描，测出光密度，计算出各种LDH同工酶的百分含量。计算方法：总光密度：T=ODLDH1+ODLDH2+ODLDH3+ODLDH4+ODLDH5【结果与分析】正常人血清LDH各同工酶活力百分比是：LDHl33.4％；LDH242.8％；LDH318.5％；LDH43.9％；LDH5l.4％。不同方法测定值略有不同。【本卷须知】所用器材必需清洁。特别是制备凝胶柱所用的玻璃管每次用后必需用洗液浸泡，再常规清洗，否那么凝胶剥离困难。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用，应防止直接接触。电泳终了后，上下槽电极缓冲液不可混合，因离子强度和pH值都已发生改动。【思索题】LDH同工酶测定的临床意义是什么实验九

RNA的分别与鉴定【目的要求】1．掌握RNA分别纯化的原理及操作方法2．熟习台式离心机的运用3.掌握RNA定量技术【实验器材】1、仪器与资料离心机一台,组织捣碎机一台，手术器械1套，天平1台。2、药品0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA匀浆缓冲液，氯仿-异戊醇混合液，RNA规范液，95％冷乙醇，地衣酚，3、动物家兔，体重2.5±0.5kg。【方法步骤】1.选取安康家兔一只，断头处死，取其肝脏，称取25g，放入组织捣碎机中，参与预冷的0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA匀浆缓冲液约130ml，高速研磨2分钟，加缓冲液至200ml，即为肝匀浆。2.分别核蛋白：肝匀浆4ml倒入试管中，3000rpm离心20min，上清倒入另一试管中为A管〔RNP提取液〕，沉淀弃去。3.A管中参与等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡2分钟，3000rpm离心15min，管内液体分三层，上层为含有RNA的水溶液，汲取上层水溶液转入B管中。4．于B管加二倍体积的95％冷乙醇，见乳白色RNA沉淀，混匀放置10min，3000rpm离心5min，沉淀为纯化RNA。5．RNA的溶解：沉淀中参与0.14mol/LNaCl2.0ml，搅拌溶解，2000rpm离心10min，上清液那么为RNA水解液。4ml肝匀浆(已加0.14mol/LNaCl)6．RNA的测定：按表2操作。试剂（ml）标准管样品管空白管RNA标准液RNA提取液蒸馏水地衣酚1.03.01.03.01.03.0混匀，沸水浴10分钟，取出冷却，以空白管调零，在670nm比色，读取光密度值，计算。【本卷须知】1.在制备肝匀浆时，应尽量在冰冷条件下进展。2.各步骤操作应力求准确，尽量减少中途核酸的丧失，保证定量测定的准确性。【思索题】1.比较讨论氯仿-异戊醇混合液，95％冷乙醇有何作用？2.为什么实验最后鉴定的是戊糖而不是其他的物质，戊糖的含量可以替代RNA的含量吗？实验十

DEAE纤维素离子交换层析法

分别蛋白质【目的要求】掌握DEAE纤维素离子交换层析法的根本原理掌握其实践操作过程，包括装柱、洗脱、测定等步骤熟习DEAE纤维素离子交换剂的构造及特点了解梯度洗脱的原理【实验器材】仪器与资料试管、烧杯、玻璃搅棒、层析柱、梯度洗脱仪等药品DEAE纤维素-22(纤维素DE22)、0.5mol/LHCL、0.5mol/LNaOH、0.01MNa2HP04、0.5MNa2HP04【方法与步骤】DEAE-22纤维素处置装柱安装梯度发生器加样洗脱检测DEAE-22纤维素处置称取DEAE-22纤维素2.5克先用40ml0.5mol/LHCL浸泡30分钟,加蒸馏水60ml反复洗涤,使上层液体没有细的混悬物,然后倒入有100目尼龙滑布的漏斗中,用蒸馏水充分洗涤,直到流出液的pH≤4止再用40ml0.5mol/LNaOH浸泡30分钟,倾弃上清液,加蒸馏水100m1,搅拌后,倒入有细尼龙布的漏斗中,用蒸馏水充分洗涤,直到流出液的pH≤8时，滤去水分将上述纤维素放入烧杯中,参与0.01MNa2HP04100m1,浸泡并搅动，放置5分钟，倾去上层液体,必要时再反复操作,直到溶液pH=8止装柱用螺旋夹扭紧层析柱下端胶管，把层析柱夹在铁支架上柱中加数毫升0.01MNa2HP04液，然后翻开出口，排出气泡，待柱中液体只剩下约1cm高时封锁出口将处置好的DEAE纤维素混悬液用吸管延续移入层析柱内，拧松下口的螺旋夹，使液体滴下全加到柱内后，待液面接近纤维素顶上界面时，把出口螺旋拧紧安装梯度发生器将梯度发生器两筒间及出口胶管的螺旋夹都拧紧，向有出口侧的筒内参与0.01MNa2HP04液40m1，另一筒内加0.5MNa2HP04液40m1把此梯度发生器放到磁力搅拌器上，搅拌子放在出口侧的盛液筒中，使梯度发生器出口细胶管内充溢掖体，排出气泡。扭紧螺旋夹，细胶管下端边到层析柱上口的胶塞上的衔接纳上加样用吸管接近床面的位置上缓慢参与血清0.5m1，翻开下口让液体缓慢流出，流速每分钟5-10滴到全部血清恰好注入床面时，立刻小心的参与0.01MNa2HP04液0.5m1,当液面接近床面时，拧紧下口螺旋夹，并把下口的胶管衔接到自动搜集器的搜集管上洗脱拧松梯度发生器两盛液筒间的螺旋夹，开动磁力搅拌器。将衔接梯度发生器两口的细胶管衔接到层析柱上端胶塞衔接纳上，使液体流入层析柱内扭松层析下端胶管的螺旋夹，控制流速约50滴/分，每搜集管搜集量约为40m1时换管，直到搜集完为止检测用紫外分光光度计测读各管的280nm的吸光度，以吸光度为纵坐标,管号为横坐标,用方格坐标纸绘出血清蛋白层析谱察看判别结果【结果与分析】不同管号中的蛋白质溶液，吸光度各异，随着管号添加，吸光度先逐渐升高然后逐渐降低这阐明经过DEAE纤维素离子交换层析法蛋白质被分别出来【本卷须知】装柱时要防止气泡产生。加样时不要搅动床面。【思索题】DEAE纤维素