第十一单元 现代生物科技专题选修3

第十一单元eq\b\lc\|\rc\(\a\vs4\al\co1(现代生物科技专题选修3))第一讲基因工程知识点一基因工程[系统主干知识]一、基因工程的概念分析二、基因工程的操作工具1．限制性核酸内切酶(简称限制酶)(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(3)结果：产生黏性末端或平末端。[特别提醒]正确认识限制酶①限制酶是一类酶，而不是一种酶。②将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。③不同DNA分子用同一种限制酶切割，产生的末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的末端一般不相同。④限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。⑤限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。2．DNA连接酶种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端和平末端作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，连接两个DNA片段3．载体(1)作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。(2)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。(3)条件eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(能自我复制,有一个至多个限制酶切割位点,有特殊的标记基因))[特别提醒]基因载体与膜载体的区别基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，它能在宿主细胞内稳定存在，并可对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。三、基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取(1)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。(2)获取方法eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(从基因文库中获取,利用PCR技术扩增,人工合成))2．基因表达载体的构建(1)构建基因表达载体的目的①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。②使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成：3．目的基因导入受体细胞项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射技术Ca2＋处理法受体细胞受精卵、体细胞受精卵原核细胞4．目的基因的检测与鉴定检测目的检测方法判断标准目的基因是否插入转基因生物的DNADNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否翻译出蛋白质抗原-抗体杂交技术是否出现杂交带个体水平的检测如抗虫、抗病的接种实验是否表现出相应的特性四、基因工程的应用1．动物基因工程：提高动物生长速度从而提高产品产量；改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。2．植物基因工程：培育抗虫转基因植物(如抗虫棉)、抗病转基因植物(如转基因烟草)和抗逆转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的品质(如新花色矮牵牛)。3．基因诊断与基因治疗(1)基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。(2)基因治疗概念把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的成果将腺苷酸脱氨酶基因转入取自患者的淋巴细胞中，使淋巴细胞能产生腺苷酸脱氨酶，然后，再将这种淋巴细胞转入患者体内，从而治疗复合型免疫缺陷症类型体外基因治疗从病人体内获得某种细胞，在体外完成基因转移，再输回患者体内体内基因治疗直接向人体组织细胞中转移基因[聚焦关键微点]一、澄清概念——所用教材的关键语句要理解透1．实现基因精确的操作过程至少需要三种工具，即准确切割DNA的“手术刀”、将DNA片段再连接起来的“缝合针”、将体外重组的DNA导入受体细胞的“运输工具”。(1)限制酶只能用于切割DNA获得目的基因。(×)(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(×)(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(×)(4)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(×)(5)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。(√)(6)用于载体的质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点。(√)2．基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤，即目的基因获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。(1)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(×)(2)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。(×)(3)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(√)(4)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点。(×)(5)目的基因导入双子叶植物细胞一般采用农杆菌转化法。(√)(6)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原－抗体杂交技术。(×)3．植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力(如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等)，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。(1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(×)(2)动物基因工程的实施主要是为了改善畜产品的品质，不一定是为了产生体型巨大的个体。(√)(3)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(×)(4)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。(×)二、科学思维——高考常见的结论性语句需记牢靠1．DNA重组技术的基本工具(1)基因工程操作的基本工具有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。(2)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别DNA分子中某种特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割。(3)E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端。(4)质粒是基因工程常用的载体，需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。2．基因工程的基本操作程序(1)基因工程的基本操作程序：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。(2)基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3)目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，导入动物细胞常用显微注射法，导入微生物细胞常用感受态细胞法(Ca2＋处理法)。(4)培育转基因动物时，受体细胞必须是受精卵；培育转基因植物时，受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。(5)检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因常用DNA分子杂交技术，检测目的基因是否转录出了mRNA同样是采用分子杂交技术，检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原—抗体杂交技术。[深化拓展提能]一、基因工程的理论基础二、基因工程的工具1．比较与DNA有关的六种酶名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端2．明确载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：三、基因工程的基本操作程序1．比较几种获取目的基因的方法方法从基因文库中获取人工合成从基因组文库中获取从部分基因文库，如cDNA文库中获取化学合成法逆转录法过程2．归纳概括目的基因检测与鉴定的方法3．归纳概括PCR技术的操作原理和过程(1)PCR反应的原理：DNA复制原理，即：eq\x(双链DNA)eq\o(,\s\up15(加热，双螺旋结构解体),\s\do15(缓慢冷却，分离的DNA链重新结合))eq\x(\a\al(单链,DNA))(2)PCR反应过程过程说明图解变性温度上升到90℃退火温度下降到55℃延伸温度上升到72℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′(3)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。[题点全训过关]题点(一)基因工程的基本工具[典例1](2019·江苏高考)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(Tetr)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题：(1)EcoRⅤ酶切位点为eq\a\vs4\al(…GAT↓ATC…,…CTA↑TAG…)，EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为________末端。(2)用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为__________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________________、____________________。菌落类型ABC无抗生素＋＋＋氨苄青霉素＋＋－四环素＋－－氨苄青霉素＋四环素＋－－(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________。[解析](1)从图中可以看出，EcoRⅤ酶切出来的载体质粒为平末端。(2)从图中可以看出，目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸，由于载体P1为平末端，所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，形成P2，这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P2连接起来。(3)由题意可知，构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏，所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活，应该选B类菌落。A类菌落能在表中所示条件下存活，说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活，说明C类菌落没有导入质粒。(4)据图分析，目的基因的外侧链只能用丙作引物，内侧链可用甲、乙作引物，如果用甲、丙作引物，则无论目的基因是否插入正确，都能通过PCR技术扩增大量目的基因；如果用乙、丙作为引物，当目的基因插入不正确(反向插入)时，则乙、丙两引物都结合在外侧，PCR不能正常进行，无法进行扩增鉴定，因此只能选用乙、丙作为引物，通过PCR鉴定目的基因是否插入正确。若扩增出的DNA片段为400bp，则正好是目的基因反向连接后，外侧链用乙作引物，内侧链用甲作引物扩增出的片段。[答案](1)平(2)胸腺嘧啶(T)DNA连接(3)BA类菌落含有P0C类菌落未转入质粒(4)乙、丙目的基因反向连接eq\a\vs4\al([规律方法])选择限制酶的技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。②质粒作为载体，必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。[对点训练]1．(2021·潍坊质检)如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是()A．甲、乙、丙都属于黏性末端B．甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能C．DNA连接酶的作用位点在乙图中b处D．切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子解析：选C由图可知，甲、乙、丙都属于黏性末端，A正确；甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；DNA连接酶将两个DNA片段连接为一个DNA分子，作用部位是磷酸二酯键，C错误；切割甲的限制酶的识别序列为：GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为：GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。2．Cre/loxP重组酶系统是对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接，从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术。其原理是重组酶Cre能识别loxP位点(特定的DNA序列)，并使loxP位点间的基因序列被重组或删除。受此启发，科学家在检测抗虫基因成功导入烟草细胞后，尝试用Cre/loxP重组酶系统删除转基因烟草细胞内的抗除草剂基因，其技术过程如图2(其中■表示启动子)。请回答下列问题：(1)通过基因改造获得抗虫烟草过程中，为大量获得抗虫基因，可选择图1中引物______(用图中罗马数字表示)组合进行PCR扩增；扩增时，为确保抗虫基因和表达载体充分连接，常在基因上、下游引物的______端添加不同的限制酶切位点，其目的是________________________________________________________________________。(2)loxP是一种含34个碱基对的小型DNA片段，由一个不对称的间隔区和两个反向重复序列组成。Cre酶能特异性地识别反向重复序列并于特定位置切开磷酸二酯键，类似于基因工程中的________酶，从遗传学角度分析，Cre酶改变质粒的原理是________________。(3)通常用______________法把携带抗虫基因的重组质粒甲导入烟草细胞，经检测导入成功后，抗除草剂基因即失去用途，继续留在烟草体内可能会引发的生物环境安全问题是________________________________________________________________________。(4)经Cre酶处理后，质粒中的两个loxP序列分别被切开，得到图2右侧的两个环状DNA分子。由于____________________________________________，抗除草剂基因不再表达，之后会在培养过程中消失。解析：(1)由于DNA聚合酶只能从5′端向3′端延伸子链，因此为大量获得抗虫基因，应该选择图1中引物Ⅱ、Ⅲ组合进行PCR扩增；扩增时，为确保抗虫基因和表达载体充分连接，常在基因上、下游引物的5′端添加不同的限制酶切位点，其目的是减少DNA自连，使抗虫基因能定向插入表达载体。(2)Cre酶能特异性地识别反向重复序列并于特定位置切开磷酸二酯键，类似于基因工程中的限制酶；从遗传学角度分析，Cre酶改变质粒的原理是基因重组。(3)将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；抗除草剂基因继续留在烟草体内可能会引发生物环境安全问题，如抗除草剂基因可能转移到杂草中，造成基因污染。(4)经Cre酶处理后，质粒中的两个loxP序列分别被切开，得到图2右侧的两个环状DNA分子。由于质粒乙的抗除草剂基因前没有启动子，抗除草剂基因不再表达，之后会在培养过程中消失。答案：(1)Ⅱ、Ⅲ5′减少DNA自连，使抗虫基因能定向插入表达载体(2)限制基因重组(3)农杆菌转化抗除草剂基因可能转移到杂草中，造成基因污染(4)质粒乙的抗除草剂基因前没有启动子题点(二)基因工程的基本操作程序和应用[典例2](2020·山东等级考)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是____________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了__________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________________________________________________________________________________________。(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(WxmRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经______________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是________________________________________________________________________。(4)各品系WxmRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是______________________________________________________________________________________________________。[解析](1)限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA连接酶能将DNA片段拼接起来。将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶的参与。转化是指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了Wx基因的转录水平，使直链淀粉合成酶基因的表达量改变。根据题干信息可知，基因编辑系统是对启动子序列进行定点编辑，由于编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子，所以与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列没有发生变化。(3)用提取的各品系胚乳中的总RNA合成总cDNA的过程为逆转录(或反转录)，需要逆转录酶的参与。由于引物能与Wx基因的cDNA特异性结合，故通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白质合成的直接模板，根据题图分析可知，3个突变品系中品系3的WxmRNA量最低，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强。[答案](1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶转化(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合不发生编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子(3)逆转录(或反转录)引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)(4)品系3品系3的WxmRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强[对点训练]3．Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。据图回答：(1)为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有________个。(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是________。(填字母，多选)A．引入短肽编码序列不能含终止子序列B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性(3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成________种DNA片段。(4)检测转化的乳酸菌发现，信号肽－重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是________________________________。(5)用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原，能够特异性识别它的免疫细胞有________。(填字母，多选)A．B细胞 B．T细胞C．吞噬细胞 D．浆细胞解析：(1)从图示可知，改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列有7个核苷酸发生了替换，则其转录形成的mRNA中，也会有7个核苷酸发生改变，一个密码子由mRNA上决定一个氨基酸的三个连续的碱基组成，由此可知，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有6个。(2)要确保等比例表达A、B肽链，则需A、B肽链一起合成，即启动子和终止子在人胰岛素A、B链编码序列两端，在其中间加入一段短肽编码序列后，序列中间不能出现终止子，所转录得到的mRNA中间也不能出现终止密码子，同时不能改变肽链的氨基酸序列和它的功能。(3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶酶切位点分别有2个和1个，当将重组表达载体用SacⅠ和XbaⅠ限制酶充分酶切后，会形成3个缺口，得到3种不同的DNA片段。(4)乳酸菌属于原核细胞，其细胞壁上的信号肽在核糖体上合成后，到细胞质基质中加工，再将其运输到细胞膜上，进而转移到细胞壁。(5)人胰岛素抗原能引起小鼠的特异性免疫，在特异性免疫过程中，B细胞和T细胞能特异性识别抗原，而吞噬细胞能识别抗原，但不是特异性识别，浆细胞不能识别抗原。答案：(1)6(2)ABCD(3)3(4)核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁(5)AB4．(2021年1月新高考8省联考·河北卷)我国约在7000年前就开始种植水稻，现在水稻已经成为我国广泛种植的重要作物。提高水分利用效率对于旱作水稻的生产有重要意义。科学家从拟南芥中获取功能基因HARDY(HRD)，并将其转入水稻中过量表达，提高了水稻的水分利用效率。回答下列问题：(1)科学家在获取拟南芥HRD基因过程中，采用了增强子作为筛选工具。增强子是一段能增强与其相连基因转录的DNA序列，将增强子插入到基因组中可得到若干个突变株系。增强子插入到基因外部，可获得基因_____________突变株；增强子插入到基因内部，可获得基因______________突变株。(2)提取拟南芥总RNA，经_____________过程获得总cDNA，利用PCR技术选择性扩增HRD基因的cDNA。以上过程依次需要用到____________和____________两种工具酶。(3)将HRD的cDNA插入到Ti质粒的________上构建重组载体，利用农杆菌侵染水稻细胞并将HRD的cDNA整合到水稻细胞染色体上。为了便于转基因植物的筛选，重组Ti质粒中必需包括________。(4)在干旱条件下，野生型(WT)和HRD增强表达的转基因水稻植株A、B(HRDA、HRDB)的根生物量(根系干重)及叶片蒸腾速率的测定结果如图所示。据图分析转基因水稻耐旱能力增强的原因包括_____________________________和__________________________。解析：(1)增强子能增强与其相连的基因的转录，所以插入到外部(启动子的上游)可促进基因转录获得基因激活突变株。增强子属于调控序列，插入内部不起作用，甚至有可能破坏基因，获得基因失活突变株。(2)RNA经过逆转录获得cDNA，逆转录要用到逆转录酶，PCR扩增要用到Taq酶。(3)将HRD的cDNA插入到Ti质粒的T­DNA上构建重组载体，Ti质粒上的T­DNA可转移并整合到受体细胞的染色体DNA上，利用农杆菌侵染水稻细胞可将HRD的cDNA整合到水稻细胞染色体上。重组Ti质粒应包含标记基因，其作用是供重组DNA的鉴定与选择。(4)由图1可知，转基因水稻的根生物量多于非转基因水稻，吸水能力增强了，同时由图2可知，转基因水稻蒸腾速率小于非转基因水稻，失水减少，从而使得转基因水稻抗旱能力增强。答案：(1)激活失活(2)逆转录逆转录酶Taq酶(3)T­DNA标记基因(4)根生物量增加，吸水能力增强蒸腾速率下降，失水减少[系统主干知识]一、蛋白质工程二、DNA的粗提取与鉴定1．实验原理(1)提取原理①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。②DNA对酶、高温和洗涤剂具有耐受性。③DNA不溶于酒精溶液。(2)鉴定原理：DNA＋二苯胺试剂eq\o(→,\s\up7(沸水浴))蓝色。2．实验流程[聚焦关键微点]一、澄清概念——所用教材的关键语句要理解透1．基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。(1)天然存在的蛋白质是经过长期进化形成的。(√)(2)自然界天然存在的蛋白质完全符合人类生产和生活的需要。(×)(3)基因工程中可利用抗原抗体杂交技术检测目的基因是否表达成功。(√)(4)基因工程的实质是将一种生物的基因转移到另一种生物体内进行表达并产生新性状。(√)2．蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。(1)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。(√)(2)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质。(√)(3)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。(×)(4)蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。(√)二、科学思维——高考常见的结论性语句需记牢靠(1)蛋白质工程的操作过程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在浓度为0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。(3)DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质可溶于酒精，可利用冷却的体积分数为95%的酒精对提取的DNA进行纯化。(4)在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。(5)哺乳动物成熟的红细胞不含细胞核，不能作为提取DNA的实验材料。若选取肝脏细胞或植物细胞，则必须充分研磨。[深化拓展提能]一、概括蛋白质工程与基因工程的关系项目蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造二、DNA的粗提取与鉴定1．比较DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同物质溶解规律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA溶解析出蛋白质NaCl溶液物质的量浓度从2mol/L逐渐降低的过程中，溶解度逐渐增大部分发生盐析沉淀溶解2．归纳DNA粗提取中的注意事项(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。(4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。[题点全训过关]题点(一)蛋白质工程[典例1](2019·海南高考)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取______作为模板，在____________催化下合成cDNA，再利用_______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的______中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_______________。(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。[解析](1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术在体外扩增获得大量Y的基因。(2)农杆菌转化法中，T­DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T­DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。[答案](1)mRNA逆转录酶PCR(2)T­DNA整合到叶肉细胞染色体DNA上(3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基eq\a\vs4\al([归纳拓展])蛋白质工程中通过基因操作来实现对天然蛋白质的改造的原因分析①蛋白质一般具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造。②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法直接遗传。[对点训练]1．已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的___________________进行改造。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：______________________________________________________________________________________________________________________。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________________和________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。解析：(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。中心法则的内容如下图所示：由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。答案：(1)氨基酸序列(或结构)(合理即可)(2)PP1DNA和RNA(或遗传物质)DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构推测氨基酸序列功能2．干扰素可以用于治疗病毒感染和癌症，但在体外保存相当困难。如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，那么，在－70℃(1)天然蛋白质的合成过程是按照________进行的，而蛋白质工程与之相反。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过__________________，对现有蛋白质进行改造，或制造新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。(2)若将干扰素的一个半胱氨酸变成丝氨酸，推测相应的脱氧核苷酸序列__________(填“是”或“不是”)唯一的。可利用PCR技术扩增相应基因，该技术的前提是要有一段________________________，以便根据这一序列合成引物。(3)干扰素基因是否翻译出蛋白质，可用______________(物质)进行检测。解析：(1)天然蛋白质的合成过程是按照中心法则中转录和翻译过程进行的，而蛋白质工程与之相反。根据蛋白质工程的概念可知，蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。(2)由于丝氨酸由多种密码子来决定，因此通过题述方法获得的脱氧核苷酸序列不是唯一的。在PCR技术中扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。(3)检测干扰素的基因是否表达，可用抗原抗体杂交法进行检测，即用(干扰素的)抗体进行检测。答案：(1)中心法则基因修饰或基因合成(2)不是已知目的基因的核苷酸序列(3)(干扰素)抗体题点(二)DNA的粗提取与鉴定[典例2](2019·江苏高考)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是()A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNAD．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热[解析]哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核和细胞器，细胞内基本不含DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；DNA析出过程中，搅拌要轻柔且沿着一个方向，以防止DNA断裂，B正确；DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入适量预冷的乙醇溶液，会使DNA析出，从而进一步提纯DNA，C正确；向溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色，D正确。[答案]A[归纳拓展]DNA粗提取与鉴定实验中的“2、4、4加蒸馏水2次①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水破裂；②加到含DNA的2mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14mol/L，使DNA析出用纱布过滤4次①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液；③滤取0.14mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④再次过滤溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液用NaCl溶液4次①加2mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA[对点训练]3．下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是()A．酵母菌和菜花均可作为提取DNA的材料B．DNA既溶于2mol/LNaCl溶液也溶于蒸馏水C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻璃棒上有白色絮状物D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝解析：选C原则上含DNA的生物材料都可用来提取DNA，只是选用DNA含量高的生物组织，成功的可能性更大；DNA在2mol/LNaCl溶液和蒸馏水中溶解度都较大；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞会吸水破裂，但在蒸馏水中不会析出DNA；DNA溶液加入二苯胺试剂后需沸水浴加热，待冷却后溶液变蓝。4．下列是“肝脏细胞DNA粗提取”实验的两个关键操作步骤，相关叙述错误的是()A．步骤1中，加入柠檬酸钠缓冲液的目的是维持pH的稳定B．步骤1中，冰浴处理的主要原理是低温下DNA酶容易变性C．步骤2中，异戊醇的作用可能是使与DNA结合的蛋白质因变性而沉淀D．步骤2中，离心后应取上清液，因为DNA在2mol/LNaCl溶液中溶解度比较大解析：选B步骤1中，加入柠檬酸钠缓冲液的目的是维持pH的稳定，A正确；低温不会使酶变性失活，只能降低酶的活性，B错误；步骤2中，异戊醇的作用可能是使与DNA结合的蛋白质因变性而沉淀，C正确；DNA在2mol/L的NaCl溶液中的溶解度比较大，因此加固体NaCl使溶液浓度达到2mol/L后再离心过滤取上清液，D正确。eq\a\vs4\al([课时跟踪检测])一、对点练小题，落实主干知识1．为了增加牡丹花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是()A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒B．用含C基因的农杆菌侵染牡丹愈伤组织，将C基因导入细胞C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上解析：选C目的基因C和质粒都有可被EcoRⅠ切割的酶切位点，另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来；愈伤组织细胞的全能性较高，是理想的植物受体细胞，将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法；质粒中含有潮霉素抗性基因，因此选择培养基中应该加入潮霉素；使用分子杂交方法可检测目的基因是否整合到受体染色体上。2．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及其切割位点分别如下：—C↓AATTG—和—G↓AATTC—如图表示某一目的基因片段与质粒拼接形成重组质粒的过程，相关叙述错误的是()A．用限制酶EcoRⅠ切割目的基因，同时用限制酶MunⅠ切割质粒B．两种限制酶切割后形成的黏性末端的碱基可以互补配对C．限制酶能使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开D．将重组质粒同时用2种限制酶切割则会形成2种DNA片段解析：选D由图可知，目的基因两侧都是限制酶EcoRⅠ的切割位点，因此应选用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子；质粒中含有限制酶MunⅠ和EcoRⅠ的切割位点，但EcoRⅠ的切割位点位于标记基因中，用其切割会破坏标记基因，因此为保证重组质粒表达载体的准确构建，应选用限制酶MunⅠ切割质粒。图中两种限制酶切割后形成的黏性末端的碱基可以互补配对。限制酶的作用是使DNA分子中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。将重组质粒同时用2种限制酶切割，则会形成3种DNA片段。3．(2021·南通模拟)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是()A．鸡的红细胞和菜花均可作为提取DNA的材料，但处理方法有所不同B．在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤收集滤液C．将NaCl溶液浓度调至2mol/L，用单层滤纸过滤获取析出物D．利用某些蛋白质在酒精中的溶解度大于DNA在酒精中的溶解度的原理，可以提纯DNA解析：选C鸡的红细胞和菜花均可作为提取DNA的材料，处理方法有所不同，动物细胞只要加蒸馏水使细胞吸水破裂，植物细胞需要加洗涤剂和食盐研磨；在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤收集滤液；将NaCl溶液浓度调至2mol/L，用多层纱布过滤获取滤液；利用某些蛋白质在酒精中的溶解度大于DNA在酒精中的溶解度的原理，可以提纯DNA。4．如图为科学家利用耐盐碱植物中的耐盐基因培育耐盐水稻新品系的过程。下列相关说法错误的是()A．阶段Ⅰ、Ⅱ应用的技术分别是DNA重组技术、植物组织培养技术B．对耐盐基因表达产物的检测可采用抗原抗体杂交技术C．可用抗生素抗性基因作为探针来检测受体细胞中是否进入了目的基因D．可用分子杂交技术检测受体细胞中的耐盐基因是否转录出mRNA解析：选C阶段Ⅰ将目的基因导入水稻细胞需要采用DNA重组技术，阶段Ⅱ将水稻细胞培养成完整植株需要采用植物组织培养技术，A正确；耐盐基因表达的产物是蛋白质，可用抗原抗体杂交技术检测，B正确；可以用含有耐盐基因的DNA探针检测细胞中是否插入了目的基因，而不是用抗生素抗性基因作为探针来检测，C错误；可用分子杂交技术检测受体细胞中的耐盐基因是否转录出mRNA，D正确。5．Bar基因存在于青麻、黑麦草等生物体内，其编码的酶可使除草剂草丁膦失去毒害作用。培育转Bar基因大豆，对于控制豆田杂草有重要意义。为了把Bar基因导入大豆细胞，需将Bar基因插入pUcl8质粒中构建中间表达载体，然后与Ti质粒重组为重组表达载体系统。如图为pUcl8质粒的结构示意图，回答下列问题：(1)不能利用黑麦草与大豆进行有性杂交的方法让大豆获得Bar基因，原因是________________________________________________________________________。(2)构建中间表达载体时，为了便于筛选出含有Bar基因的重组质粒，需将Bar基因插入到pUcl8质粒的________中形成重组质粒并导入大肠杆菌，然后在添加________________的培养基上培养大肠杆菌，菌落呈白色的即为含中间表达载体的大肠杆菌。(3)中间表达载体需插入到Ti质粒的________中才能将Bar基因整合到植物细胞的染色体DNA上，原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)可通过____________法直接将重组表达载体导入大豆细胞的原生质体。导入Bar基因的原生质体需________________，经脱分化形成____________，再进一步分化才能获得转Bar基因大豆植株。解析：(1)由于黑麦草与大豆之间存在生殖隔离，因此不能利用黑麦草与大豆进行有性杂交的方法让大豆获得Bar基因。(2)根据图中信息可知，lacZ基因编码β­半乳糖苷酶，β­半乳糖苷酶可以将培养基中的X­gal水解，使菌落呈蓝色，否则菌落呈白色。因此，构建中间表达载体时，为了便于筛选出含有Bar基因的重组质粒，需将Bar基因插入到pUcl8质粒的lacZ中形成重组质粒并导入大肠杆菌，然后在添加氨苄青霉素和X­gal的培养基上培养大肠杆菌，菌落呈白色的即为含中间表达载体的大肠杆菌。(3)Ti质粒上的T­DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T­DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。(4)可通过显微注射法直接将重组表达载体导入大豆细胞的原生质体。导入Bar基因的原生质体需再生出细胞壁，经脱分化形成愈伤组织，再进一步分化才能获得转Bar基因大豆植株。答案：(1)黑麦草与大豆之间存在生殖隔离(2)lacZ氨苄青霉素和X­gal(3)T­DNAT­DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上(4)显微注射再生出细胞壁愈伤组织6．如图1所示为用PvuⅠ限制酶切下的某目的基因及其上DNA片段示意图；图2所示为三种质粒示意图，图中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，Tetr为四环素抗性基因，EcoRⅠ、PvuⅠ等为限制酶及其切割的位点。复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，是指质粒在受体细胞中复制时的起点。请回答：(1)组成片段D的基本骨架与细胞膜的基本骨架相同的元素是____________。(2)图2中质粒A、质粒C能否作为目的基因载体最理想的质粒？________(填“能”或“否”)，请说明理由。_________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)重组质粒成功导入受体细胞的概率一般仅为10－7。用质粒B构建重组质粒，为了筛选出导入了重组质粒的大肠杆菌，在导入完成后，将所有大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养，大肠杆菌在两种培养基的生长状况不可能的是__________________________________________________，可能性最大的是________________________________________________。(4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物，则需要将重组质粒导入至山羊的________(细胞)中。解析：(1)脱氧核糖和磷酸交替连接，构成DNA片段(D)的基本骨架，脱氧核糖由C、H、O三种元素组成，组成磷酸的元素是H、P、O；磷脂双分子层构成细胞膜的基本骨架，磷脂分子是由C、H、O、N、P组成，可见组成片段D的基本骨架与细胞膜的基本骨架相同的元素是C、H、O、P。(2)分析图2可知，质粒A缺少标记基因，质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被限制酶切割，进而影响重组质粒的自主复制，所以质粒A、质粒C均不能作为目的基因载体最理想的质粒。(3)用质粒B构建重组质粒，当用和目的基因相同的限制酶(PvuⅠ)切割时，Tetr(四环素抗性基因)遭到破坏，而AmpR(氨苄青霉素抗性基因)结构完好，因此在重组质粒导入完成后，将所有大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养，大肠杆菌在两种培养基的生长状况不可能的是在含四环素的培养基上能正常生长，在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长。因重组质粒成功导入受体细胞的概率一般仅为10－7，所以可能性最大的是在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长。(4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物，则需要将重组质粒导入山羊的受精卵中。答案：(1)C、H、O、P(2)否质粒A缺少标记基因，质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被限制酶切割，会影响重组质粒的自主复制(3)在含四环素的培养基上能正常生长，在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长(4)受精卵二、仿真练高考，注重答题规范7．已知镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常；而人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙型肝炎疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。回答下列问题：(1)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作________________________________。(2)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的______，以其作为模板，在____酶的作用下反(逆)转录合成cDNA。cDNA与载体需在限制酶和__________酶的作用下，构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。(3)如图为“乙肝基因工程疫苗”的生产和使用过程，质粒中lacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X­gal，从而使菌落显现出蓝色，若无该基因，菌落则成白色。图中过程①有两种限制酶选择方案，它们分别是____________________或______________________。(4)获取目的基因的方法除了图中用酶切的方法从细胞中分离以外，还可以通过______________________________来获得。据图可知，该目的基因的具体功能是_________________________________。(5)为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入_________________，培养一段时间挑选出________色的菌落进一步培养获得大量目的菌。解析：(1)蛋白质工程通过基因修饰或基因合成，实现对现有蛋白质的改造或制造新蛋白质，由于该操作中没有对蛋白质进行改造或基因进行修饰，因此不属于蛋白质工程。(2)因为血红蛋白基因只在早期红细胞中表达，所以可从其中提取mRNA，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下反(逆)转录合成cDNA。构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶协助。(3)根据图解可知，含有目的基因的外源DNA和载体上都有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ和EcoRV的识别序列和切割位点，用EcoRV切割会破坏目的基因，因此图中过程①有两种限制酶选择方案，它们分别是只用BamHⅠ或同时用EcoRⅠ和BamHⅠ。(4)获取目的基因的方法有：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。根据图中④目的基因最终产生乙肝病毒外壳进行接种，说明该目的基因具体功能是指导合成乙肝病毒蛋白。(5)用限制酶BamHⅠ切割时破坏了lacZ基因，但没有破坏青霉素抗性基因，因此为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入青霉素和X­gal，根据题干信息“质粒中lacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X­gal，从而使菌落显现出蓝色，若无该基因，菌落则成白色”可知，培养一段时间挑选出白色的菌落进一步培养获得大量目的菌。答案：(1)不属于没有对现有的蛋白质进行改造(或没有对基因进行修饰)(2)mRNA(或RNA)逆转录DNA连接(3)只用BamHⅠ或同时用EcoRⅠ和BamHⅠ(4)人工合成(或PCR技术扩增)指导乙肝病毒蛋白质外壳的合成(5)青霉素和X­gal白8．(2021年1月新高考8省联考·广东卷)CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，对该研究有突出贡献的科学家被授予2020年诺贝尔化学奖。我国科学家领衔的团队利用CRISPR/Cas9等技术，将人的亨廷顿舞蹈病致病基因(HTT基因)第1外显子(其中含150个CAG三核苷酸重复序列)“敲入”猪基因组内，获得了人猪“镶嵌”HTT基因，利用胚胎工程技术成功地构建了亨廷顿舞蹈病的动物模型。回答下列问题：(1)PCR技术是获得人HTT基因常用的方法，制备PCR反应体系时，向缓冲溶液中分别加入人HTT基因模板、4种脱氧核糖核苷酸及____________等，最后补足H2O。(2)CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列，由此可见，Cas9在功能上属于________酶。与CRISPR/Cas9相比，限制酶的特性决定了其具有____________的局限性。(3)在实验过程中，为确认实验猪细胞基因组内是否含有人猪“镶嵌”HTT基因，常用的检测手段包括PCR技术及________。(4)含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞在体外培养时通过细胞分裂，数量不断增加，当细胞贴壁生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖，这种现象称为____________。贴满瓶壁的细胞常用____________进行消化处理，以便进行传代培养。(5)将含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞的过程，称为____________。此后进行体外胚胎培养并移植到代孕母猪体内，最终获得亨廷顿舞蹈病动物模型。解析：(1)PCR技术需要的条件是基因模板、4种脱氧核糖核苷酸作为原料及引物和Taq酶等。(2)Cas9可以切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列，由此可见，Cas9在功能上属于限制性核酸内切酶。与CRISPR/Cas9相比，限制酶只能识别和切割特定序列，这一特性决定了其具有作用对象单一的局限性。(3)在实验过程中，为确认实验猪细胞基因组内是否含有人猪“镶嵌”HTT基因，可以通过PCR技术及基因探针技术来检测。(4)当细胞贴壁生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖，这种现象称为接触抑制。贴满瓶壁的细胞常用胰蛋白酶进行消化处理，以便进行传代培养。(5)将含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞的过程，称为核移植。答案：(1)引物和Taq酶(2)限制性核酸内切作用对象单一(3)基因探针技术(4)接触抑制胰蛋白酶(5)核移植9．(2021·滨州一模)基因工程的第一步是筛选获取目的基因，利用PCR技术获取目的基因是一种常用的手段。图示某DNA分子经酶切后，DNA片段自身环化并利用PCR技术扩增的部分过程。请回答下列问题：(1)PCR与生物体内DNA复制过程不同，解旋时不需要________催化，而是通过______________实现的，因此PCR技术使用的DNA聚合酶必须是________________的。(2)如果在某基因组中定位了一个目的基因X，其碱基序列未知，但已知X临近区域的一段DNA序列，此时可利用图示方法进行目的基因的筛选和扩增。作用于图示多个酶切点的限制酶种类应________(填“相同”或“不同”)。操作时根据图中的________设计引物，将含有目的基因的DNA片段克隆出来。为便于目的基因与载体结合，可在________添加特定的限制酶识别序列。解析：(1)PCR与体内DNA复制的不同之处主要表现在温度环境的不同，在PCR中先用90～95℃高温处理的目的是使DNA变性(使DNA的两条链解开)，而这一过程中在细胞内是通过解旋酶的催化实现的。所以PCR技术解旋不需要解旋酶，通过90～95℃高温处理来实现。PCR反应包含多次循环，每次循环包括变性、复性和延伸，PCR技术在较高温度下进行，因此需要耐高温(耐热或热稳定)的DNA聚合酶。(2)根据图示，用PCR技术扩增X基因时，酶切后有自身环化现象，说明酶切后形成的末端碱基序列相同，所以作用于图示多个酶切点的限制酶种类应该相同。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。题中目的基因X碱基序列未知，X临近区域的一段DNA序列已知。操作时需要根据图中已知序列的一段DNA序列设计引物。为了便于扩增后的X基因与质粒连接，常在两条引物上设计加入特定的限制酶识别序列，主要目的是使X基因能定向插入表达载体。答案：(1)解旋酶90～95℃高温处理耐高温(耐热或热稳定)(2)相同已知序列两条引物10．(2021·汕头校级模拟)人体内的tPA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的基因工程tPA会诱发颅内出血，其原因在于tPA与纤维蛋白结合的特异性不高。研究证实，将tPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的tPA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良tPA蛋白(注：如图表示相关的目的基因、载体、限制酶识别序列和切割位点，pCLY11为质粒，新霉素为抗生素)。请回答下列问题：(1)以上制造出性能优异的改良tPA蛋白的过程被称为____________工程。(2)已知人tPA基因序列已测出，且第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的模板链碱基序列为AGA，因此要获得改造后的目的基因最好采用____________________方法获得。(3)若tPA改良基因的黏性末端如图所示，那么需选用限制酶XmaⅠ和__________切开质粒pCLY11，才能与tPA改良基因高效连接。在基因工程中，最核心的一步为________________________________。(4)一般选择在未加入新霉素的培养基中生存的大肠杆菌作为受体细胞，目的是__________________________________________。在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株，原因是______________________________________________，这时需选择呈__________色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良tPA蛋白的工程菌株。解析：(1)在原有的tPA蛋白基础上改良蛋白质结构，属于蛋白质工程。(2)由于tPA蛋白基因的序列已知，因此可以使用化学方法人工合成的方法获得目的基因。(3)目的基因的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知所使用的限制酶为XmaⅠ和BglⅡ，要想把目的基因与载体拼接起来需要得到相同的黏性末端，因此载体也需要XmaⅠ和BglⅡ切割；基因工程中最核心的一个环节为基因表达载体的构建。(4)选择未加入新霉素的培养基中生存的大肠杆菌作为受体细胞，这些细胞没有新霉素的抗性，当其导入重组质粒后，质粒上的标记基因使得大肠杆菌具有新霉素抗性，这样可以选择导入质粒pCLY11的大肠杆菌；由于标记基因存在于原有质粒上，若未连目的基因的质粒导入到大肠杆菌中，这些大肠杆菌也可以获得新霉素的抗性；而区分重组质粒和原有质粒的一个标志可以观察mlacZ基因的表达情况，由于重组质粒拼接了目的基因，破坏了mlacZ基因，因此在重组质粒中该基因不表达，菌落呈现白色，而导入非重组质粒的大肠杆菌由于该基因保存完整，可以表达，所以菌落呈现蓝色。答案：(1)蛋白质(2)化学方法人工合成(3)BglⅡ基因表达载体的构建(4)以便筛选出导入质粒pCLY11的大肠杆菌含有未连目的基因质粒的大肠杆菌也可以在这种培养基上生长白第二讲细胞工程知识点一植物细胞工程[系统主干知识]一、细胞工程的概念原理和方法细胞生物学和分子生物学操作水平细胞水平或细胞器水平目的按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品二、植物细胞的全能性概念具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能原理细胞内含有本物种的全部遗传信息全能性表达条件具有完整的细胞结构，处于离体状态，提供一定的营养、激素和其他适宜外界条件三、植物组织培养1．理论基础：植物细胞具有全能性。2．基本过程3．应用(1)植物繁殖的新途径：微型繁殖、作物脱毒、制备人工种子。①微型繁殖优点：能够保持亲本的优良性状。②作物脱毒：利用茎尖、根尖等无毒组织进行微型繁殖。③培育人工种子：可以解决某些植物结实率低、繁殖困难的问题。(2)作物新品种的培育：单倍体育种、突变体的利用。(3)细胞产物的工厂化生产。四、植物体细胞杂交1．理论基础：植物体细胞融合利用了细胞膜的流动性，杂种细胞培育成杂种植株利用了植物细胞的全能性。2．基本过程3．意义：克服了不同种生物远缘杂交不亲和的障碍。[特别提醒]体内细胞未表现全能性的原因是基因的表达具有选择性。[聚焦关键微点]一、澄清概念——所用教材的关键语句要理解透1．具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能，也就是说，每个生物细胞都具有全能性的特点。(1)棉花根尖细胞经诱导形成幼苗能体现细胞的全能性。(√)(2)物种不同，细胞的全能性不同，一般是植物细胞>动物细胞。(√)(3)一般情况下，分化程度越高的细胞其全能性越低。(√)(4)由于已分化的细胞都有一整套和受精卵相同的核DNA分子，因此细胞具有全能性。(√)(5)一般情况下植物体细胞不表达细胞的全能性。(√)2．植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体植物器官、组织、细胞培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整植株。(1)愈伤组织是外植体通过脱分化和再分化后形成的。(×)(2)植物组织培养时，固体培养基中的琼脂提供营养成分。(×)(3)常选用胡萝卜根的形成层进行组织培养。(√)(4)植物组织培养过程中生长素和细胞分裂素的比值始终不变。(×)(5)植物组织培养过程中所用器械需要进行消毒处理。(×)3．植物体细胞杂交是指将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。(1)利用物理法或化学法可以直接将两个植物细胞进行诱导融合。(×)(2)再生出细胞壁是原生质体融合成功的标志。(√)(3)诱导细胞融合时，化学法一般是用聚乙二醇作为诱导剂。(√)(4)形成杂种细胞就完成了植物体细胞杂交过程。(×)(5)细胞融合时不只形成杂种细胞，还形成同种细胞融合的细胞。(√)二、科学思维——高考常见的结论性语句需记牢靠(1)植物组织培养的基本过程eq\x(外植体)eq\o(→,\s\up7(脱分化),\s\do5())eq\x(愈伤组织)eq\o(→,\s\up7(再分化),\s\do5())eq\x(根、芽)→eq\x(植物体)(2)植物体细胞杂交的理论基础是细胞膜的流动性和植物细胞的全能性，动物细胞融合的理论基础是细胞膜的流动性和细胞增殖。(3)植物体细胞杂交用到的酶是纤维素酶和果胶酶，动物细胞培养用到的酶是胰蛋白酶或胶原蛋白酶。(4)人工诱导原生质体融合的方法分为物理法和化学法，物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般是用聚乙二醇作为诱导剂；动物细胞融合常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电激等。[深化拓展提能]1．植物组织培养与植物细胞培养的比较比较项目植物组织培养植物细胞培养利用原理细胞全能性细胞增殖培养基固体培养基液体培养基培养对象离体的植物器官、组织、细胞或原生质体由愈伤组织分散得到的悬浮细胞培养过程外植体→脱分化→再分化→芽、根→植物幼苗愈伤组织→分散成悬浮细胞→继代培养→细胞代谢产物培养目的植物幼苗细胞的代谢产物二者关系植物细胞培养是植物组织培养的基础；它们都属于植物细胞工程的范畴2．比较植物组织培养和植物体细胞杂交名称植物组织培养植物体细胞杂交原理细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性和细胞的全能性过程选材选取根尖、茎尖、形成层部位，最容易诱导脱分化