一文掌握“小鼠葡萄糖代谢”相关试验要点

一文掌握“小鼠葡萄糖代谢”相关试验要点肥胖是造成代谢紊乱如「胰岛素抵抗」的常见危险因素，对于肥胖的研究，最常见的动物模型就是60%高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠肥胖，此模型与临床肥胖症的病理相似，稳定性好，10周左右就可以看到明显的表型。表型出现后，除了测量体重之外，更需要衡量的就是体内胰岛素抵抗水平和葡萄糖耐量，通俗来说就是机体对葡萄糖分解代谢的能力，这个时候我们可以外源性地给小鼠葡萄糖后来监测一定时间段内的血糖情况，也就是葡萄糖耐量检测，如果是通过口服给予葡萄糖，就是口服糖耐量试验(「oralglucosetolerancetestj)简称为：「OGTT」；如果是通过腹腔注射来给予葡萄糖，就是经腹腔注射葡萄糖耐量检测(fintraperitonealglucosetolerancetestj)简称为「IPGTTJ如果葡萄糖耐量降低，机体消耗葡萄糖的能力下降，在外源给予葡萄糖之后，血糖相对迅速上升而下降缓慢。在临床上，这个实验也十分普遍，当然，临床中是通过口服葡萄糖来实现的，这个试验也是临床诊断糖尿病的金标准。相反地，如果外源给予胰岛素，检测特定时间段内的血糖水平，就是胰岛素耐量实验(「insulintolerancetest,insulin-inducedhypoglycemiatestj)简称为「ITTJ,而外源性胰岛素的给予方式，是通过腹腔注射来实现的；如果出现了胰岛素不敏感，在注射胰岛素之后，血糖相对下降缓慢而上升较快。总之，OGTT和ITT是两个评价代谢状态的经典实验，两者分别评估了葡萄糖耐量和胰岛素抵抗的情况，如果葡萄糖是经过腹腔给予的，那么就是IPGTT试验，本质上和OGTT是一样的。理清了OGTT和ITT的基本概念之后，我们分别看看两者是具体怎么实现的首先我们来了解一下OGTT试验如何实施。大体上来讲，小鼠的OGTT试验就是在小鼠空腹12-16小时后给予适量水平的葡萄糖后，选择6个常规时间点监测血糖的过程。小鼠血糖如何测量？给予葡萄糖的量是多少？6个时间点如何选择？多只小鼠同时进行如何协调？都是我们需要注意的问题。小鼠准备我们取血的途径是从小鼠尾部获得，在正式进行OGTT试验前的一周，可以进行小鼠「掐尾适应训练」，这样小鼠在正式实验时能够从容面对，从而避免应激性的高血糖。在正式试验的前一天，给小鼠换上干净的垫料，饥饿14小时（比如前一天晚上的18:00正式开始饥饿，次日早上8:00开始实验）。葡萄糖的准备准备10毫升左右的20%的葡萄糖，一定要注意是试剂级别的葡萄糖以及溶解葡萄糖的双蒸水是无菌的。小鼠称体重根据体重计算葡萄糖溶液的用量，常用剂量是1g/kg，如果一只小鼠重30g,那么需要给它准备150ul的葡萄糖了。同时保证小鼠标号清楚，同时进行多只小鼠的OGTT实验，时间的管理就尤为重要，不要在识别小鼠上面浪费时间。小鼠取血和基础血糖检侧尾尖剪去1-2mm，弃掉第一滴，用第二滴检测血糖；动作轻柔，避免应激性的高血糖，同时也可以用小刀划口子取血，血糖的检测只需要3ul，如果利用毛细管引流，可以收集到30ul,可以用于其他指标的测量。图片来源：参考文献给予葡萄糖根据计算的葡萄糖的体积，通过灌胃或腹腔注射给小鼠相应剂量的葡萄糖，在灌胃的过程中一旦遇到任何阻力，不要强行灌注，极有可能误入了气管，此时应该退出灌胃针，重新进针。当第一只小鼠灌胃成功后，按下计时器倒计时15分钟，在此期间应保证所有小鼠都灌胃成功，如果按照一只小鼠1分钟操作时间计算得话，同一批次进行实验的小鼠不要超过15只。保证在计时器响起得那一刻，第一只被灌胃的小鼠可以进行第一个时间点也就是15分钟的血糖测量。图片来源：参考文献其余时间点得血糖监测重复上面的步骤，在30,60,90,120min的时间点分别监测血糖，时间点可以自己设置，如果选择180min或者更长的时间点监测，那么，应该保证小鼠在此期间有足够的饮水；实验吉束小鼠放回笼子，保证充足的饮水和食物，小鼠的OGTT实验对与它的消耗是很大的，所以，如果要再次进行OGTT或者进行ITT试验得话，应该保证至少一周的间隔时间。其次我们再来了解一下小鼠的ITT试验基本要点和OGTT实验相似，不同的是，胰岛素是通过腹腔注射给予的，并且饥饿时间应该缩短至2-5h，因为长时间的饥饿容易发生小鼠在实验过程中的低血糖休克，所以为了避免这样的情况发生，掌握好胰岛素的剂量就显得非常重要，常用剂量为0.75U/Kg，同时提前准备好20%的葡萄糖，一旦发生低血糖休克，立即灌胃葡萄糖进行抢救。图片来源：参考文献时间点的选择上，推荐15,30,60,90,120min,再长时间点得检测是没有意义的，因为胰岛素的半衰期只有10分钟，超出2小时后血糖水平与胰岛素就没有关系了。最后，我们应该对实验数据进行整理，并进行绘图呈现出来，典型的结果如下图，分别是OGTT（左）和ITT（右）的结果图，分别是高脂饮食组（60%脂肪）HFD和低脂饮食组（10%脂肪）LFD组，每组30只;左图是在在过夜禁食之后，灌胃给予葡萄糖（1g/Kg）后的15,30,45,60分钟后检测血糖水平，我们可以看到高脂饮食组血糖迅速上升且幅度较大，而下降相对缓慢，说明出现了葡萄糖耐量减退；右图是空腹状态的小鼠给予腹腔注射胰岛素（0.75U/Kg）后的15,30,45,60分钟的血糖水平，可以看出高脂饮食组血糖下降减慢而且幅度较低，说明出现了胰岛素抵抗。图片来源：参考文献OGTT和ITT是衡量代谢的经典实验，值得我们学习和掌握。参考文献：StudyofInVivoGlucoseMetabolisminHigh-fatDie