基因诊断和基因治疗

基因诊断和基因治疗GeneDiagnosisandGeneTherapy第三讲SectionⅠGeneticDiagnosis基因诊断内源性基因变异

基因结构突变基因表达异常外源基因的入侵基因诊断的依据—基因变异:核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）聚合酶链式反应(PCR)单链构象多态性（SSCP）限制性内切酶谱分析法

限制性片段长度多态性（RFLP）DNA序列测定（DNAsequencing）生物芯片（biochips）1.核酸分子杂交：

在复性过程中，将不同来源的单链DNA分子或RNA分子放在同一溶液中，只要在DNA或RNA的单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，就可以在不同的分子间形成杂化双链，这种现象称为核酸分子杂交。探针技术探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的同源序列。标记物：同位素、生物素或荧光染料探针种类(广义）：DNA(合成的寡聚核苷酸片段、基因组DNA、cDNA)、RNA、Protein（1）Southern印迹杂交：提取受检者DNA→限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离→变性处理DNA成单链→DNA转印到膜上并使其牢固结合→将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信号。

印迹技术基本原理凝胶电泳

转移

杂交

放射自显影或化学显色（2）Northern印迹杂交：提取受检者体内mRNA，经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交，检测受检者体内特定的mRNA分子的含量与大小。（3）等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交

寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，因此可用人工合成的、针对正常和突变等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交，检测点突变。根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸(M)；二是相应于正常基因碱基序列的寡核苷酸(N)，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交。如：载脂蛋白apoB-100缺陷症的诊断apoB基因编码3500号氨基酸残基的密码子

CGGCAG

精氨酸谷氨酰胺

野生型探针5′-GCACACGGTCTTC

(N)突变型探针5′-GCACACAGTCTTC(M)纯合突变：只与M杂交，不与N杂交杂合突变：既与M杂交，又与N杂交无突变：只与N杂交，不与M杂交新类型突变:既不与M杂交，也不与N杂交2.聚合酶链式反应

(polymerasechainreaction,PCR）模板引物dNTP

Mg2+

Taq

DNA聚合酶变性延伸退火3.PCR/单链构象多态性分析（PCR-SSCP)（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）：相同长度的单链DNA基因碱基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能形成不同的空间构象，从而在电泳时泳动速率不同。其他方法还有PCR/ASO法、PCR/限制性酶谱法、PCR/RFLP法。PCR-SSCP分析原理示意22222222222222222222222由于基因的突变使DNA单链的构象发生改变，电泳时其区带位置发生改变，但是具体是哪个碱基发生突变还需要通过测序确定。4.限制性内切酶谱分析法

利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。如镰状红细胞贫血：β珠蛋白第六个密码子发生单个碱基突变:AT

谷缬0.2kb5.限制性片段长度多态性（RFLP）分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）

在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异（称为中性突变），中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片断，称为限制性片段长度多态性(RFLP)。

RFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片断紧密连锁，就可用这一多态性片段作为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。

6.基因芯片技术

基因芯片（Genechip/DNAchip）又称为DNA微矩阵，是包被在固相载体上的高密度DNA的微阵列。即将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列、固定于单位面积的支持物上。(1)基因芯片的类型：寡核苷酸芯片：采用固相原位合成技术制备的，或用传统方法合成后再固定于芯片上的寡核苷酸探针阵列。DNA微矩阵（DNAMicroarray）：将DNA探针通过自动化点样技术固定于特定的固相支持物如玻璃表面，然后再与靶序列杂交。(2)基因芯片技术的原理

DNA芯片技术是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列、固定于支持物（如膜、硅片或玻璃片）上，然后通过类似核酸杂交的的方法与待测的标记样品按碱基配对原则进行杂交，再通过检测系统对其进行扫描，并用相应软件对信号进行比较和检测，得到所需的生物信息。其特点是可进行基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究。(3)基因芯片技术的应用:疾病诊断（遗传病、肿瘤和病原体诊断）新药筛选和毒理学研究突变/多态性检测单核苷酸的多态性

(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。基因表达分析发现新基因(4)表达谱基因芯片的特点及其应用利用基因芯片可进行高通量基因表达平行分析，是基因功能研究的重要手段。对来源于不同个体（正常人与患者）、不同组织、不同细胞周期、不同发育和分化阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导、不同治疗阶段）下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交，可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。目录采用表达谱基因芯片研究基因表达与传统的NorthernBlot相比有许多重要的优点：

检测系统的微型化，对样品等需要量非常小同时研究上万个基因的表达变化，研究效率明显提高能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，从而研究基因与基因之间内在的联系检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表达情况

节约费用和时间

1.遗传病的基因诊断：遗传病是指由于基因发生突变所引起的、可以传给子代的疾病。遗传病包括：（1）单基因遗传病：由于单个基因座上存在着基因突变而引起的遗传病。（2）多基因遗传病：多个基因座存在基因突变。

2、恶性肿瘤的基因诊断:

癌基因被激活而过量表达或抑癌基因丢失可导致肿瘤发生，因此对肿瘤的诊断可检测癌基因突变或抑癌基因的突变。如：约一半以上的肿瘤都有抑癌基因P53的点突变，常见的点突变主要发生在第5、6、7、8外显子中。

P53的突变的检测方法：（1）PCR-SSCP：此法可检测出发生突变的外显子。（2）DNA序列分析：可以确定点突变的位置及缺失/插入密码子的数目。基因诊断除用于细胞癌变机制的研究外，还可对肿瘤进行诊断、分类分型和愈后检测。3、致病病原体的检测:

对于外源入侵的基因，一旦阐明其部分核酸序列，就可以设计引物和探针，用PCR或杂交方法来检测，其范围包括细菌、病毒、衣原体和支原体等一切微生物。基因诊断的特点是：可以其基因中的保守区做通用检测，也可以选定差异较大的基因部位做分型检测；检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法所需时间已达到临床要求。这对于难以培养的病毒（如HBV）、细菌（如结核、厌氧菌）和原虫（如梅毒螺旋体）等来说尤为适用。

基因诊断在判断个体对某种重大疾病的易感性方面也起着重要作用。基因诊断在器官移植组织配型中的应用也日益受到重视。基因诊断在法医学中应用主要针对人类DNA遗传差异进行个体识别和亲子鉴定。SectionⅡGeneTherapy基因治疗一、基因治疗的概念及分类：

1.基因治疗的概念：

通过分子生物学的方法将外源治疗基因导入靶细胞并有效表达，达到治疗疾病的目的。

是以改变细胞遗传物质为基础的治疗。

狭义的基因治疗，是指将目的基因导入靶细胞后，与宿主细胞内的基因发生整合，成为宿主遗传物质的一部分，使目的基因的表达产物对疾病起到治疗作用。

广义基因治疗：

①外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物，以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质；②采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因；③将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；④向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到治疗疾病的目的。目录2.基因治疗分类:体细胞(somaticcell)基因治疗生殖细胞(germline)基因治疗只限于某种体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代基因矫正或置换———基因打靶补偿性基因治疗（基因增补）干扰性基因治疗：如反义核酸治疗，包括反义RNA/反义DNA，抗核酸，核酶，干扰RNA等。非特异性基因治疗：导入与致病基因无直接关系的基因如细胞因子基因和自杀基因等二、基因治疗的方法和策略1.基因矫正或置换———基因打靶利用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替换细胞内的病变基因，以纠正细胞的遗传缺陷，从而使疾病得到治疗。特点：不影响其他任何基因的改变。基因矫正或置换基本条件：①目的基因能有效导入靶细胞②目的基因能在靶细胞内稳定驻留③导入的目的基因能正常表达④导入的目的基因对宿主细胞完全无害

将外源基因导入病变细胞，不去除异常基因，使导入的外源基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能。这一方法也需基因置换的基本条件。已应用于临床：如严重联合免疫缺陷症（SevereCombinedImmunodeficiencyDisease，SCID)的基因治疗——第一个基因治疗的例子（1990）2.补偿性基因治疗（基因增补）SCID是由于腺苷脱氨酶(ADA)缺陷造成的。该酶基因位于#22染色体该基因缺陷使嘌呤核苷酸不能彻底分解，中间分解产物的积累阻止了T细胞的正常发育，同时影响B细胞的成熟（因为B细胞的成熟需要T细胞的帮助），从而引起免疫缺陷。由于患者失去细胞免疫功能，一旦感染很容易造成死亡。

治疗：取出患者T淋巴细胞→体外培养增殖→导入正常的ADA基因并有效表达→输回患者体内.September14,1990@NIH完成第一个基因治疗的病例------Ashanti(4yearoldgirl)→抽取患者T淋巴细胞，体外利用

retrovirusvector

把ADAgene导入体外培养的T淋巴细胞，使该基因正常表达后把T细胞移植回患者体内。Cynthia(9yearoldgirl)wastreatedinsameyear

缺点:WBC半衰期很短，必须定期反复治疗又如，凝血因子VIII/IX基因缺陷———血液中凝血因子VIII/IX缺乏———血友病A/B

向骨髓干细胞导入以上凝血因子的正常基因可以治疗血友病。1992年，复旦大学蔡京伦教授在国内首先成功。3.干扰性基因治疗(基因失活):

利用反义核酸进行基因治疗反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。包括反义RNA、反义DNA和核酶(ribozymes)三大技术。

反义RNA是指能和mRNA完全互补的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段；

反义DNA是指能与基因DNA双链中的有义链互补结合的短小DNA分子；具有酶催化活性的RNA称之为核酶。近年发展起来的反基因策略：肽核酸（peptidenucleicacid,PNA)基因敲除（geneknock-out)技术干扰RNA技术肽核酸(PeptideNucleicAcids,PNAs)一类人工合成的用蛋白质骨架代替核酸中的磷酸核糖骨架而形成的新型分子,由于PNA的电中性骨架，分子中不含磷酸基团，因此PNA更容易和带有负电荷的互补序列的DNA或RNA结合。形成的复合物分子较DNA/DNA双链或DNA/RNA杂交链更为稳定。PNA与核酸杂交具有高亲和性及高特异性。(1)长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的Ｄicer核酸酶切成21～23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA(2)小干扰RNA与蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体，该复合体可识别与小干扰RNA有同源序列的ｍRNA，并在特异的位点将该ｍRNA切断。干扰RNA4.非特异性基因治疗：导入与致病基因无直接关系的基因如增强免疫能力的基因或自杀基因。①自杀基因来自细菌或病毒，人体没有。②自杀基因导入肿瘤细胞,其蛋白产物是一类核苷酸的转化酶，可以把一些无毒或低毒的核苷酸药物前体转化成细胞毒性物,选择性的杀死快速分裂的肿瘤细胞。常用的自杀基因：单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK)；大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（EC-CD）优点：①可降低用药量②降低对正常细胞的毒副作用。三、基因治疗的途径

细胞介导的体外基因治疗直接向患病部位注射/喷雾治疗基因体内基因治疗，关键是建立靶向表达载体和确定基因表达水平。基因治疗的体外和体内途径：载体目的基因invivoexvivo靶细胞目录四、病毒介导非病毒介导（一）治疗性基因的选择

适用于单基因变异性疾病，SCID（重症联合免疫缺陷综合症），可选用腺苷脱氨酶(ADA)基因治疗。选用VEGF（血管内皮生长因子）基因治疗血管栓塞性疾病。VEGF可刺激侧支循环的建立，改善梗阻部位的血液供应。

选用特定的反义核酸，封闭细胞内活化的原癌基因（如：erbB2）的表达，可抑制肿瘤生长。（二）基因载体选择

载体两大类：病毒载体，非病毒载体，一般多采用病毒载体。

病毒载体：

利用病毒对哺乳细胞的感染力以及可在细胞内复制的能力，通过对其基因的改造构建无害化的病毒载体。许多病毒DNA经过适当改造后，可用作载体把外源治疗基因转移到受体细胞，并使之有效表达。常用的病毒载体有：逆转录病毒RV

、腺病毒AV和腺相关病毒AAV等。常用基因治疗的病毒载体

整合致病性感染细胞克隆容量反转录病毒载体随机整合，效率高可能致病分裂细胞<7kb腺病毒载体不整合，可能丢失不致病分裂细胞、非分裂细胞

腺相关病毒载体定点整合(19号染色体特定区域)不致病分裂细胞、非分裂细胞<5kb<7.5kb

现在腺病毒载体已更多的应用于肿瘤的基因治疗，因为它安全，可以携带大的外源基因，可以转导分裂的或非分裂的细胞。（三）靶细胞的选择靶细胞有两大类：体细胞和生殖细胞，但目前禁用生殖细胞，仅用体细胞。靶细胞特点：

1、具有接受外源DNA的能力

2、易从体内取出

3、导入外源DNA后，经培养再输回体内仍能成活。常用的靶细胞有：骨髓干细胞、淋巴细胞、造血细胞、肝细胞、肿瘤细胞等。（四）基因转移即把外源治疗基因导入靶细胞并使其有效表达。是基因治疗成功的关键。1.物理化学的方法（非病毒载体转移技术）物理法：（1）电穿孔法将目的DNA与受体细胞混合，在高电压作用下给细胞一个电脉冲，使受体细胞出现瞬间可逆性开启，使外源DNA通过膜孔进入细胞内。（2）显微注射法：用显微镜注射法把目的DNA注入受体细胞，更适合于生殖细胞的基因治疗（如受精卵细胞的注射）此外还有超声波法，基因枪技术(微粒子轰击法)等。

基因直接注射技术的优点：

不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。

将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%；将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ。

化学法：（1）磷酸钙沉淀法：把目的DNA溶解在Hepes溶液中，然后缓慢加入Na2HPO2·CaCl2溶液中，目的DNA可被包在磷酸钙溶液中，它可被细胞吞噬，目的基因便进入细胞内。（2）DEAE-Dextran法（二乙胺乙基萄聚糖法）将DNA溶解在TBS[含TrisK+Na+

等]缓冲液中与DEAE-Dextran混合，滴加到受体细胞表面，目的DNA便可进入细胞内。（3）脂质体介导基因转移法脂质体是由PL、Ch等形成的一种可以高效包装的人造单层膜。与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。

2.病毒载体基因转移法利用病毒DNA作为载体，整合到宿主细胞的基因组内。

脂质体介导的基因转移示意图目录（五）外源基因的表达筛选：利用载体中的标记基因对转染细胞进行筛选，在表达载体中有neor(neomycinresistance)标记的抗药物G418基因存在。在加入药物G418的培养液中被转化细胞可存活，而未被转化的细胞不能存活。（六）回输体内：将带有治疗基因的细胞回输体内而发挥作用。如：淋巴细胞可静脉回输入血，造血细胞可自身骨髓移植方法等。五、

临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临两大难题：（1）患者机体内的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度存在差异，特别是某些经过多次化疗的患者，其体内的肿瘤细胞已经产生了多药耐药性，对多种化疗药物产生交叉耐受，最终导致化疗失败。（2）大剂量的化疗可能导致患者的正常细胞，特别是骨髓造血细胞的功能受到抑制。肿瘤的基因治疗研究肿瘤基因治疗要达到以下三个目的：

A增加机体免疫功能，即杀伤肿瘤细胞

的能力

B抑制癌基因的表达，或导入正常的抑

癌基因逆转肿瘤细胞的恶性表型

C增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性☻干扰性基因治疗：通过基因干预，抑制肿瘤细胞中过度表达的癌基因，从而降低其恶性表型。☻自杀基因治疗：直接杀死肿瘤细胞。☻肿瘤的免疫基因治疗：激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能。☻提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏基因治疗；耐药基因治疗。

肿瘤基因治疗的策略1.干扰性基因治疗

反义核酸技术——把人工合成的DNA/RNA片段导入肿瘤细胞，它们可以与癌基因DNA/mRNA的特定部位结合，从而抑制癌基因的转录或翻译。这些DNA/RNA片段称为反义核酸。

核酶——

具有催化活性的RNA，设计特定的核酶，使之可以特异的识别和切割癌基因的mRNA或病毒RNA。

抗核酸——

是一些单链DNA片段，可与癌基因的某一部位特异结合形成三股DNA，从而封闭基因的表达。

RNA干扰（interferenceRNA,RNAi）：

21～23bp的双链RNA，可以识别和结合癌基因mRNA的特定部位，促进mRNA的降解，从而抑制癌基因的表达。例如癌基因bcl-2在Burkitt淋巴瘤中过表达,抑制细胞凋亡和增加癌细胞的抗药性，向癌细胞中导入bcl-2mRNA的反义核酸，可抑制

bcl-2的表达，降低癌细胞的抗药性，和诱导细胞凋亡。2．补替缺陷基因（补偿性基因治疗）向缺失某种抑癌基因的细胞导入正常的抑癌基因，可逆转其表型，抑制其增殖，诱导其凋亡。

用腺病毒载体向小鼠前列腺癌导入治疗基因P53，2天后细胞开始凋亡，3周后前列腺癌消失。3．向肿瘤细胞导入细胞因子或其受体基因（非特异性基因治疗）

增加机体的局部免疫功能例如：IL-2TNF-αGM-CSFINFαHLA-B7HLA-B27等从而：①促进免疫效应细胞的分化增殖，增加对肿瘤细胞的杀伤能力②直接杀伤肿瘤细胞(如TNF-α)③增加肿瘤细胞的免疫原性④调节其他细胞因子的分泌

药物增敏基因治疗：

为了使化疗药物能够最大程度地杀死肿瘤细胞，可以将某些药物增敏基因导入肿瘤细胞，特别是对化疗药物原本不敏感的肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物的敏感性大大增加，从而达到增强化疗效果的目的。

4．向肿瘤细胞导入药物敏感基因

（自杀基因）

例1：丙氧鸟苷/胸嘧啶激酶（GCV/HSV-tk）