植物基因工程导论

第9章植物基因工程〔plantgeneengineering〕植物的基因植物基因工程原理和方法转基因研究进展植物分子生物学与生物工程植物基因的结构植物基因的表达调控叶绿体基因组线粒体基因组第一章、植物的基因第一节植物分子生物学与生物工程一、植物基因组方案及基因克隆基因组Genome：指一种生物的全套基因和染色体。基因组学Genomics：对基因组进行作图、测序和分析的学科。分成两支：结构基因组学和功能基因组学。结构基因组学：构建生物的遗传图谱、物理图谱和转录本图谱及其全序列测序。功能基因组学：研究和评价基因功能包括生化、细胞、发育、适应等。植物基因组方案可从根本上奠定研究植物的遗传——发育——进化理论的新的根底。植物基因组方案以拟南芥和水稻最引人注目。拟南芥方案从1989年开始，目前全序列已在网上公布。国际水稻基因组方案〔IRCP〕从1991年启动。另外一些植物的基因组方案在进行之中，如玉米、大豆、番茄、油菜、桃、苹果等。美国国家植物基因组方案国家植物基因组方案于1997年5月启动，1998年1月工作组正式公布了国家植物基因组方案的前5年规划。国家植物基因组方案是与人类基因组工程(HGP)并行的庞大的工程。

一、NPGI的内容、目标及进展

NPGI的研究内容分为三局部：第一，结构基因组研究(StructuralGenomics)，即研究基因组的结构和组织；第二，功能基因组研究(FunctionalGenomics)，即鉴别基因组序列的作用，研究基因组结构和组织与植物功能在细胞、有机体和进化上的关系；第三，将基因组的信息和知识用于开发改进植物和以植物为根底的新型产品。

联邦政府主要侧重于第一和第二局部的研究，第三局部的应用研究主要由私人部门承担。

NPGI的长期目标是了解那些对农业、环境、能源和健康具有重要意义的植物基因的结构和功能，并应用这些知识来改善人类社会。1、拟南芥和水稻基因组测序

2、结构基因组研究

结构基因组研究旨在绘出包括玉米、大豆、小麦、大麦、高粱、水稻、棉花、西红柿和松树等10—12种具有经济价值的关键植物的基因图谱。为了寻找在经济作物中缺少的或没有表达的有用基因，少数非经济植物也在考虑之列。

截至1999年8月，已有玉米、水稻、西红柿和大豆等13种植物的基因组草图被保存在由美国国立医学图书馆管理的基因库(GeneBank)中。

3、功能基因组研究

拟南芥Arabidopsisthaliana

——植物界的“果蝇〞拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。Smallgenome(114.5Mb/125Mbtotal)hasbeensequencedintheyear2000.Extensivegeneticandphysicalmapsofall5chromosomes.Arapidlifecycle(about6weeksfromgerminationtomatureseed).Prolificseedproductionandeasycultivationinrestrictedspace.EfficienttransformationmethodsutilizingAgrobacteriumtumefaciens.Alargenumberofmutantlinesandgenomicresources.Multinationalresearchcommunityofacademic,governmentandindustrylaboratories.二、植物发育的分子生物学研究

遗传——发育——进化的研究将成为理论生物学关注的中心问题。如：花发育的分子机理——ABC模型胚胎发育的分子机理受精作用根的发育激素及各种信号分子对发育的影响等三、物质代谢过程的分子生物学光合作用机理生物固氮〔固氮酶〕初生代谢调控次生代谢调控四、生物中心法那么的有关理论问题DNA复制、转录、翻译及转录后、翻译后的加工转基因中外源基因和宿主核基因组之间的关系转基因中的共抑制现象〔外源基因转入后抑制同源序列的功能，涉及转录及转录后阻滞〕和基因沉默〔所转基因不表达，并不是丧失或突变，而是失活〕五、植物抗性分子生物学提高抗性改进品质和提高产量生物反响器植物病毒分子生物学植物分子遗传与分子进化环境保护的分子生物学等第二节植物的基因基因的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。高等植物的核编码基因与其他真核生物的基因结构类似。高等植物的主要基因类型有：器官与组织专一性表达的基因和受环境因素诱导而表达的基因。一、器官与组织专一性表达的基因2、生殖器官中P2基因——编码参与花粉管萌发与生长时果胶解聚作用的蛋白质，在雄蕊的成熟花粉〔管〕中表达；Def基因——编码转录因子，发生突变造成雄性器官转换成雌性器官，只在雌蕊中表达；PAL2基因——编码苯丙氨酸解氨酶，参与花色素合成，只在花瓣中表达；3、种子中二、受环境因素诱导而表达的基因热休克基因低温诱导的基因水涝诱导基因脱水诱导基因创伤诱导基因病菌感染诱导基因三、植物编码基因的结构

高等植物的编码基因主要包括以下四个区域：5’上游区5’非翻译区编码区3’非翻译区A、5’上游区——指基因转录起始点5’上游包括启动子在内的一段很长的区域。其中包括与基因转录起始与表达调控有关的许多元件。特点：在起始点附近具有一致顺序：CTCATCA在转录起始点上游〔－32±7bp处〕有TATAbox，顺序为TCACTATATAG的，在其上游-75bp附近还有CAATbox，顺序为GC〔T/C〕CAATCT。TATAbox对RNA聚合酶Ⅱ准确进行起始转录是必需的，CAATbox有增强基因转录的功能。还含调控元件，有增强或阻遏表达的；有决定基因在特定时空表达顺序的；有对激素或外界胁迫有应答作用的顺序。由于他们与基因位于同一条DNA链上，又称顺式作用元件〔cis-actingelements〕。B、5’非翻译区——基因的转录起始位点到翻译起始密码子之间的一段序列。该区的5’端是前体 mRNA加帽〔7-甲基鸟嘌呤核苷〕的位点。有些基因该区还有一些茎环结构，它们与翻译密码子的旁邻顺序对翻译的效率有影响。有些植物在此区还有内含子，有增强基因表达的作用。C、编码区——从翻译起始密码到终止密码子之间的一段区域，或这一区域中所有外显子成分。特点：大局部植物基因以5’端的第一个AUG作为翻译起始密码子；外显子4种核苷酸的比例：单子叶AU约43%，双子叶54%；主要差异在密码子的第三个碱基上，单子叶偏向于选择A和U。编码区常含内含子，有些可增强基因表达；D、3’非翻译区

——指转录本终止密码子后面的一段顺序。其中有一些调控元件，对mRNA的稳定性和翻译效率起重要调节作用。在mRNA末端有1~2个加polyA信号，多数植物基因为AAUAAA。5’3’AGGA或CAATboxTATAbox加帽位点加尾信号AB信号肽序列翻译起始翻译终止123外显子内含子第三节植物基因的表达调控

植物基因表达的调控可在三个水平上进行：转录水平、转录后加工和翻译水平。一、转录水平的调控

指从DNA在聚合酶Ⅱ作用下合成前体mRNA这一过程中的调节。主要从以下5个方面进行：1、染色质的结构压缩与松散、解开2、DNA甲基化3、转录起始复合物4、顺式作用元件5、反式作用因子反式作用因子

在基因转录中，除转录起始复合物外，还有许多核蛋白起着重要调节作用，它们与相应的顺式作用元件相互作用以增强或阻遏基因的表达，或决定着基因表达的组织与发育阶段专一性。这类核蛋白称为反式作用因子，或转录因子。二、转录后加工编码蛋白质的核基因转录成前体RNA〔hnRNA〕后，要经过5’端加帽〔mTG〕与3’端加尾〔polyA〕，同时将内含子剪切掉，才形成成熟的mRNA。内含子的剪接是有剪接体参与完成的，它由多种小分子的核糖核蛋白颗粒组成。剪接位点多是内含子两端的GU〔GU和AG〕。各种因素可影响剪接体正确正常地剪除内含子。三、翻译水平的调节遗传信息从mRNA翻译成多肽大致可分为起始、延伸和终止三个阶段。一些蛋白因子与tRNA的浓度影响上述阶段。5’翻译区的茎——环结构影响翻译的速率，mRNA的polyA在翻译上起重要作用。mRNA的稳定性〔具帽、具尾的完整结构的保持〕也是影响表达的因素之一。第四节叶绿体基因组和线粒体基因组

高等植物除具有核基因组外，还存在两种半自主性器官——叶绿体和线粒体。它们具有基因组，和核基因组一起共同调控植物的生长发育。一、叶绿体基因组及其编码的基因叶绿体遗传物质的研究始于1909年Bear等人对高等植物花斑病的研究；1962年Ris等首次证实叶绿体中存在着DNA；1975年第一次得到纯化的完整的叶绿体基因组〔ctDNA〕；1976年建立了玉米的ctDNA物理图谱；以后对ctDNA的多种RNA和蛋白质基因进行了定位。1、叶绿体基因组大局部植物的ctDNA分子在120~160kb之间，最小的是绿藻Codiumfrasile，只有8kb；最大的是巨大绿藻，约2000kb。ctDNA的显著特点是含反向重复序列IR〔InvertedRepeat〕，它把ctDNA分成大单拷贝区LSC〔10~85kb〕和小单拷贝区SSC〔10~20kb〕。另一特点是：具相同或相关功能的质体基因聚于同一操纵子组成复合操纵子，分布于ctDNA上。2、cpDNA所含的基因控制遗传的基因光系统基因ndh基因3、cp基因的表达调控受核基因的调控光调控细胞分化调控4、cp遗传工程将C3植物改造成C4植物将非豆科植物转化成固氮植物叶绿体发育机理、光合作用机理等研究提高光合效率、开发次生代谢产物叶绿体转化二、线粒体基因组线粒体基因组也叫线粒体DNA〔mtDNA〕，大小在200~2500kb之间。高等植物mtDNA在ATP产生、光呼吸和氨基酸碳骨架形成中有重要作用。其环状DNA分子由主环和含有直接或倒置重复的小环组成。mtDNA所含的主要基因RNA基因rRNA基因〔rDNA〕tRNA基因〔tDNA〕蛋白质基因r—蛋白基因细胞色素氧化酶基因ATP合成酶基因阴离子通道蛋白基因ndh1，2，3，4，5〔NADH去氢酶亚基的基因〕线粒体基因组除了这个高分子的主基因组外，某些植物的线粒体还含有较小的线性或环性DNA分子。在某些植物中还检测到小的环状的隐形质粒。这些小的DNA分子有或无同细胞质雄性不育〔CMS〕存在相关性。第二章植物基因工程原理和方法第一节植物基因工程开展简史

自1983年首次获得转基因烟草、马铃薯以来，短短十余年间，植物基因工程的研究和开发进展十分迅速。国际上获得转基因植株的植物已达100种以上，包括水稻、玉米、马铃薯等作物；棉花、大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济作物；番茄、黄瓜、芥菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生菜、芹菜等蔬菜作物；苜蓿、白三叶草等牧草；苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果；矮牵牛、菊花、香石竹、伽蓝菜等花卉；以及杨树等造林树种。应该说转基因植物研究取得了令人鼓舞的突破性进展。

第二节植物基因工程原理和方法一、基因工程的工具酶基因工程中的工具酶依用途分：限制性内切酶如DNA限制性内切酶和甲基化酶，通过切割DNA分子，对含有特定基因的片段进行别离、分析连接酶如T4DNA连接酶，将两段甚至数段DNA片段连接起来修饰酶如DNA聚合酶、反转录酶、碱性磷酸酶等，用于DNA分子的体外合成、体外突变、序列分析、修复等。二、目的基因别离和鉴定1、目的基因性质抗病毒、细菌和真菌杀死害虫或供害虫拒食抵抗各种除草剂抵抗逆境提高植物体中蛋白质或其它物质的含量或品质2、目的基因来源来自于植物本身来自动物和微生物人工合成1、通过基因产物的分析和鉴定

〔1〕基因标签法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物基因文库别离目的基因。

2、通过遗传表型分析3.从研究缺失突变体的表型着手别离基因5、从大的基因组区域直接别离编码序列

三、植物表达载体构建目的基因被别离后，往往需要经过修饰才能应用于植物基因工程。构建植物表达载体就是：在目的基因的5’端加上启动子，在基因的3’端加上终止子，以便使外源基因能在植物中有效表达，充分发挥其功能。四、受体的遗传转化1、植物基因转化的受体非整株水平叶圆片原生质体悬浮细胞胚性愈伤组织胚状体小孢子其它：如子叶、胚轴、茎段、根等。2、基因转化的方法外源基因直接导入〔物化方法〕农杆菌介导的转化〔生物法〕转化方法原理特点农杆菌介导

1、共培养法（原生质体、悬浮细胞、愈伤组织共培养）2、叶圆盘（片）法3、活体接种法含可转移的T—DNA的质粒作为外源DNA载体，通过农杆菌对宿主的浸染而将目的基因导入受体，并整合到受体基因组中进行表达

1、受体类型广泛，多水平；2、简单易行、转化效率高；3、受宿主范围限制，单子叶植物常受限；4、转化体常“嵌合”；5、影响因子少

直接导入法

1、圆球体法2、脂质体法3、显微注射法4、PEG法5、电激法6、基因枪法7、超声波法8、激光微束法用不同的方法直接将外源基因导入到受体细胞中

1、不受宿主限制；2、受体水平多层次；3、多数方法需原生质体作受体（1~6），周期长，转化效率低；4、部分方法需专门的设备仪器，操作复杂；5、影响转化频率的因素多，难以控制

花粉管通道法

将供体DNA从雌花顶部引入子房，使其沿着花粉管生长时在花柱中开辟的通道进入胚囊。

简单易行，可直接得到转化的种子；但受季节限制

五、基因工程细胞和植株的筛选和鉴定

为了有效地选择转化细胞，植物细胞遗传转化中常用选择标记和报告基因。1、选择标记选择标记的要求：能抑制植物细胞的正常生长，但并不杀死植物细胞；有简便的方法可以检测其在转化细胞或植株中的表达。即使在选择压力下，也不是所以存活的细胞或再生植株都是转化了的，总会有一些逃避过选择。常用的选择标记基因标记基因选择剂特征检测nptⅡ新氯霉素磷酸转移酶基因抗生素如卡那霉素、庆大霉素等编码的酶通过磷酸化使抗生素失活存活者为转化子双亲叶酸脱氢酶基因氨甲喋呤表达产物对氨甲喋呤产生抗性同上hpt潮霉素磷酸转移酶基因潮霉素B表达产物对潮霉素产生抗性同上cat氯霉素乙酰转移酶基因氯霉素编码酶催化氯霉素形成乙酰氯霉素同上2、报告基因

一种理想的报告基因应具有以下特征：在植物中的本底很低或没有其产物对代谢没有不利影响表达产物有适度的稳定性以利于检测测定方法应简单、灵敏，可以定量事实上，现用的报告基因中还没有可满足上述全部条件的。许多抗生素选择标记基因可作报告基因，如nptⅡ、cat等。常用报告基因报告基因编码产物检测特点冠瘿碱合成酶基因来自农杆菌T—DNA冠瘿碱合成酶纸电泳检测冠瘿碱对大多数植物有效GUS基因来自大肠杆菌4—MUG4—MU在365nm下激发可产生荧光分光光度法定性、定量测定灵敏方便，应用最广，但在果实、种皮、胚乳等中存在假阳性现象LUC基因来自萤火虫兰色沉淀组织化学方法测定，通过染色定位迅速、灵敏、无害，但设备昂贵GFP基因来自水母绿色荧光蛋白在蓝光或紫外光及有氧存在时发绿色荧光不需底物，迅速、灵敏、无害，但设备昂贵花青素生物合成调控基因C1、B、R来自玉米色素目测受细胞类型及发育时期影响3、转基因植株鉴定抗性标记和报告基因进行快速鉴定分子生物学检测

SouthernBlotNorthernBlotWesternBlotPCR生物学鉴定第三章转基因植物研究进展一、植物转基因的目的：以某一植物种的优良的栽培品种或有希望推广应用的品种作起始材料，针对其某一缺点或缺乏之处转进一个或几个控制特定性状的目的基因〔抗虫，抗病，抗除草剂基因〕，使转基因植物既保存原有的各种优良的农艺性状，同时又增加一个或几个新的目的基因控制的性状。二、转基因植物研究概况

植物转基因研究起始于70年代末和80年代初，首例转基因植物于1983年在烟草和马铃薯上获得成功，至2002年底，现有230余种植物转基因已获成功。1、提高抗性：抗虫、抗病、抗除草剂、抗盐碱、抗衰老、抗热及抗冷冻等。2、改进作物品质：改变蛋白质、碳水化合物、油脂组分、维生素、矿物元素含量等。主要应用领域1、农杆菌介导的基因转化〔Agrobacterium-mediatedtransformation〕。2、以原生质体或悬浮培养细胞或胚性细胞团块作为受体的直接基因转化(Directgenetransformation)。3、种质系统的基因转化(Germlinetransformation):利用子房、幼穗、种胚注射外源基因，DNA溶液浸泡萌动的种胚以及刚受精的花粉管通道途径向刚启动分裂的合子胚导入外源基因。农杆菌介导的水稻遗传转化流程图（以潮霉素作为筛选剂为例）生根[MS+Met2+NAA0.5+CH500+S20g/L+Hm50+Cb250(pH5.8)]3-4w预培养(取受粉10-14d的未成熟种子剥取幼胚)水稻幼胚于[NB+2,4-D2(mg/L,下同)+NAA0.5+KT0.5+CH500+S40g/L+Gelrite1.8g/L(pH5.8)]上4-5d

农杆菌感染

愈伤组织