工业微生物实验技术课件

实验室建设及设备仪器

1.1实验室建设1.1.1微生物实验室设计微生物实验室由准备室、洗涤室、灭菌室、无菌室、恒温培养室和普通实验室六部分组成。这些房间的共同特点是地板和墙壁的质地光滑坚硬，仪器和设备的陈设简洁，便于打扫卫生。1.1实验室建设1.1.2微生物实验室基本要求（一）准备室准备室用于配制培养基和样品处理等。室内设有试剂柜、存放器具或材料的专柜、实验台、电炉、冰箱和上下水道、电源等。（二）洗涤室洗涤室用于洗刷器皿等。由于使用过的器皿已被微生物污染，有时还会存在病原微生物。因此，在条件允许的情况下，最好设置洗涤室。室内应备有加热器、蒸锅，洗刷器皿用的盆、桶等，还应有各种瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。1.1实验室建设（三）灭菌室灭菌室主要用于培养基的灭菌和各种器具的灭菌，室内应备有高压蒸汽灭菌器、烘箱等灭菌设备及设施。（四）无菌室无菌室也称接种室，是系统接种、纯化菌种等无菌操作的专用实验室。在微生物工作中，菌种的接种移植是一项主要操作，这项操作的特点就是要保证菌种纯种，防止杂菌的污染。在一般环境的空气中，由于存在许多尘埃和杂菌，很易造成污染，对接种工作干扰很大。1.1实验室建设

1.无菌室的设置无菌室应根据既经济又科学的原则来设置。其基本要求有以下几点：（1）无菌室应有内、外两间，内间是无菌室，外间是缓冲室。房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。内间面积2×2.5＝5m2，外间面积1×2＝2m2，高以2.5m以下为宜，都应有天花板。（2）内间应当设拉门，以减少空气的波动，门应设在离工作台最远的位置上；外间的门最好也用拉门，要设在距内间最远的位置上。

1.1实验室建设（3）在分隔内间与外间的墙壁或“隔扇”上，应开一个小窗，作接种过程中必要的内外传递物品的通道，以减少人员进出内间的次数，降低污染程度。小窗宽60cm、高40cm、厚30cm，内外都挂对拉的窗扇。（4）无菌室容积小而严密，使用一段时间后，室内温度很高，故应设置通气窗。通气窗应设在内室进门处的顶棚上（即离工作台最远的位置），最好为双层结构，外层为百叶窗，内层可用抽板式窗扇。通气窗可在内室使用后、灭菌前开启，以流通空气。有条件可安装恒温恒湿机。

1.1实验室建设

2.无菌室内设备和用具（1）无菌室内的工作台，不论是什么材质、用途的，都要求表面光滑和台面水平。（2）在内室和外室各安装一个紫外灯（多为30W）。内室的紫外线灯应安装在经常工作的座位正上方，离地面2m，外室的紫外线灯可安装在外室中央。（3）外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、盛有来苏儿水的瓷盆和毛巾、手持喷雾器和5%石炭酸溶液等。（4）内室应有酒精灯、常用接种工具、不锈钢制的刀、剪、镊子、70%的酒精棉球、工业酒精、载玻璃片、特种蜡笔、记录本、铅笔、标签纸、胶水、废物筐等。1.1实验室建设

3.无菌室的灭菌消毒（1）薰蒸：这是无菌室彻底灭菌的措施。无菌室使用了较长时间，污染比较严重时，应进行薰蒸灭菌。可用甲醛、乳酸或硫磺薰蒸。（2）喷雾：在每次使用无菌室前进行。喷雾可促使空气中微粒及微生物沉降，防止桌面、地面上的微尘飞场，并有杀菌作用。可用5%石炭酸喷雾。（3）紫外线照射：在每次使用无菌室前进行。紫外线有较好的杀菌效果。通常应开启紫外线灯照射30～60min。1.1实验室建设

4.无菌室工作规程（1）无菌室灭菌。每次使用前开启紫外线灯照射30min以上，或在使用前30min，对内外室用5%石炭酸喷雾。（2）用肥皂洗手后，把所需器材搬入外室；在外室换上已灭菌的工作服、工作帽和工作鞋，戴好口罩，然后用2%煤酚皂液将手浸洗2分钟。（3）将各种需用物品搬进内室清点、就位，用5%石炭酸在工作台面上方和操作员站位空间喷雾，返回外室，5～10min后再进内室工作。1.1实验室建设

（4）接种操作前，用70%酒精棉球擦手；进行无菌操作时，动作要轻缓，尽量减少空气波动和地面扬尘。（5）工作中应注意安全。如遇棉塞着火，用手紧握或用湿布包裹熄灭，切勿用嘴吹，以免扩大燃烧；如遇有菌培养物洒落或打碎有菌容器时，应用浸润5%石炭酸的抹布包裹后，并用浸润5%石炭酸的抹布擦拭台面或地面，用酒精棉球擦手后再继续操作。（6）工作结束，立即将台面收拾干净，将不应在无菌室存放的物品和废弃物全部拿出无菌室后，对无菌室用5%石炭酸喷雾，或开紫外线灯照射30min。1.1实验室建设（五）恒温培养室

1.培养室的设置（1）培养室应有内、外两间，内室是培养室，外室是缓冲室。房间容积不宜大，以利于空气灭菌，内室面积在3.2×4.4＝14m2左右，外室面积在3.2×1.8＝6m2左右，高以2.5m左右为宜，都应有天花板。（2）分隔内室与外室的墙壁上部应设带空气过滤装置的通风口。（3）为满足微生物对温度的需要，需安装恒温恒湿机。（4）内外室都应在室中央安装紫外线灯，以供灭菌用。1.1实验室建设

2.培养室内设备及用具（1）内室通常配备培养架和摇瓶机（摇床）。常用的摇瓶机有旋转式、往复式两种。（2）外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、手持喷雾器和5%石炭酸溶液、70%酒精棉球等。

3.培养室的灭菌、消毒同无菌室的灭菌、消毒措施。小规模的培养可不启用恒温培养室，而在恒温培养箱中进行。1.1实验室建设（六）普通实验室进行微生物的观察、计数和生理生化测定工作的场所。室内的陈设因工作侧重点不同而有很大的差异。一般均配备实验台、显微镜、柜子及凳子。实验台要求平整、光滑，实验柜要足以容纳日常使用的用具及药品等。（七）实验室其他要求水、电、气等的容量、布设、性能均应满足实验室工作的需要。返回1.2实验环境控制

1.2.1检验的方法（一）平板检验法用培养微生物主要类群的常规培养基，如牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏1号培养基、马丁氏培养基、马铃薯葡萄糖培养基，分别倒成平板，每种两个，都放入无菌室内。检验时，按无菌操作各将其中一个平板的盖子打开，经过预定时间后再行盖好；另外一个不开盖子的作为对照，一起放入30℃环境培养，48小时后检验有无菌落生长。

1.2实验环境控制

（二）斜面检验法将常用的牛肉膏蛋白胨培养基斜面(与上相同)各取2管，放入无菌室。按无菌操作各将其中的一管打开棉塞，将棉塞放入灭菌的培养皿内。经过预定时间后，再将棉塞通过火焰塞好试管。连同对照一起培养，48小时后检验有无杂菌生长。

1.2实验环境控制

1.2.2检验时间（一）空气灭菌后的检验无菌室用甲醛或其它药剂熏蒸后，在开始使用前30min或1小时打开培养皿盖子，至使用无菌室时盖好，其目的是为了检验无菌室内空气灭菌的效果。（二）紫外线灭菌效果的检验无菌室用紫外线灯照射后，可在不同高度和不同位置用琼脂平板检验空气中的杂菌，以判断紫外线的灭菌效果。必要时应调整照射时间或紫外线灯的高度。1.2实验环境控制

（三）操作过程中空气污染情况的检验为了检验在使用无菌室的过程中，由于人员的进出、器材的搬放、接种操作的动作等原因造成的空气污染的情况，可在准备工作结束后接种操作开始时打开盖子，经5min、30min或直到工作结束时再盖好，以检验在不同的使用时间内空气污染的程度。1.2实验环境控制

1.2.3检验结果分析检验用的平板或斜面，在30℃培养48小时后，检验是否长有菌落、菌落的数量，并由菌落形态判断杂菌的种类。一般要求平板开盖5min者应不超过3个菌落；斜面开塞30min者应不长菌落为合格。从空气中杂菌的种类可以考虑采取有效措施，增进灭菌效果。如霉菌较多，可先用5%石炭酸灭菌后，再用甲醛熏蒸；如细菌较多时，可采用乳酸与甲醛交替熏蒸的办法。返回

1.3常用仪器及其使用要领

1.3.1显微镜（一）显微镜的基本结构普通光学显微镜由机械和光学两大部分组成。机械部分包括镜座、镜臂、载物台、物镜转换器、镜筒和调节器等；光学部分包括目镜、物镜、聚光器、虹彩光圈及反光镜。显微镜结构的各部分见图1-1。

1.3常用仪器及其使用要领

图1-1显微镜构造示意图

1.物镜转换器；2.物镜；3.游标卡尺；4.载物台；5.聚光器；6.虹彩光圈7.光源；8.镜座；9.点源开关；10.光源滑动变阻器；11.粗调螺旋；12.微调螺旋；13.镜臂；14.镜筒；15.目镜；16.标本移动螺旋

1.3常用仪器及其使用要领

1.镜筒镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜筒有单筒和双筒两种。单筒有直立式和后倾式两种。双筒全是倾斜式的，其中一个筒有屈光度调节装置，以备两眼视力不同者调节使用。两筒之间可调距离，以适应两眼宽度不同者调节使用。

2.物镜转换器转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个孔，用于安装不同规格的物镜。

1.3常用仪器及其使用要领

3.载物台又称镜台，是放置标本的地方，多数为方形和圆形的平台，中央有一通光孔；载物台上有移动器，作用是夹住和移动标本，转动螺旋可使标本前后和左右移动，其上的刻度标尺可指明标本所在位置。

4.镜臂镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式（可改变倾斜度）两种。

1.3常用仪器及其使用要领

5.镜座镜座连接镜臂，支撑整台显微镜，其上有反光镜。

6.调焦装置调节物镜和被观察物体之间距离的机件。有镜臂调节器和镜台调节器两种，前者通过升降镜臂来调焦距，后者通过升降载物台来调焦距。包括大、小螺旋调节器各一个，前者又称粗调节器，后者也叫微调节器，通过调节器调焦，可清晰地观察到标本。

1.3常用仪器及其使用要领

7.物镜是接近被观察物品（标本）的镜头，亦称接物镜。根据物镜的放大倍数和使用方法的不同，分为低倍物镜、高倍物镜和油镜三种，低倍物镜有4×、10×、20×；高倍物镜有40×和45×；油镜有90×、95×和100×等。数字越大，放大倍数越高。

8.目镜是接近观察者的眼睛的镜头，亦称接目镜。把经物镜放大的实像再放大一次，并映入观察者的眼中。通常有5×、10×、16×等规格。

1.3常用仪器及其使用要领

9.聚光器安装在载物台下，能将平行的光线聚焦于标本，增强照明度。聚光器可以升降。

10.反光镜是普通光学显微镜的取光设备，使光线射向聚光镜，分平、凹两面。

11.内光源是较好的光学显微镜自身带有的照明装置，安装在镜座内部，由强光灯泡发出光线，通过安装在镜座的集光镜射入聚光镜。

1.3常用仪器及其使用要领

（二）显微镜的使用方法

1.显微镜的放置从显微镜箱或柜内取出或放入显微镜时，应一手提镜臂，另一手托镜座，让显微镜直立，防止目镜从镜筒中脱落。显微镜应直立放置在桌上。离桌缘3cm，检查各部件是否完好，镜身、镜头必须清洁。

2.标本放置下降载物台或升高镜筒，使物镜远离载物台，将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。

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3.低倍镜观察将低倍镜对正下方，侧面注视，用粗调节器调节上升载物台或下降镜筒，使物镜与玻片接近，距离约0.5cm处，开放光圈，下降聚光器。如有内置光源灯可通过调节电压以获取适当的照明亮度；如使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数，选用凹面或平面反光镜并调节其角度。再由目镜观察，同时转动粗调节器下降载物台或升高镜筒使物镜缓缓远离玻片，标本在视野中显现后，再使用微调节器调节至图像清晰。

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4.高倍镜观察在低倍镜下找到合适的目标并将其移至视野中心后，侧面注视，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至正下方。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后，用微调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦状态，这种现象称为物镜的同焦。

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5.油镜观察使用同焦显微镜时，在高倍镜或低倍镜下找到要观察的区域后，移开镜头，在待观察的区域滴加1～2镜油，将油镜转至油中，调节光强，使视野的亮度合适，用微调节器调节物像清晰为止。对于不等焦的显微镜，用粗调节器下降载物台或升高镜筒使物镜逐渐远离玻片，在标本观察区滴加镜油，然后将油镜转至镜筒下方，须在侧面注视下，用粗调节器调节上升载物台或下降镜筒，使物镜与玻片接近，将油镜前端浸入镜油中，并几乎与标本相接

1.3常用仪器及其使用要领

6.显微镜用毕后的处理用粗调节器使物镜远离玻片，取下载玻片。用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许镜头清洗液擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的镜头清洗液。切忌用手或其它纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。用擦镜纸清洁其它物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。

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（三）显微镜的维护和保养显微镜是贵重精密的光学仪器，正确的使用、维护与保养，不但观察物体清晰，而且延长显微镜的使用寿命。

1.显微镜应放置在通风干燥，灰尘少，不受阳光直接曝晒的地方。不使用时，用有机玻璃或塑料布防尘罩罩起来。也可套上布罩后放入显微镜箱内或显微镜柜内，并在箱或柜内放置干燥剂。

2.显微镜要避免与酸、碱及易挥发具腐蚀性的化学物品放在一起，以免显微镜受损。

1.3常用仪器及其使用要领

3.显微镜应防止震动和暴力。粗、微调节螺旋、聚光器螺旋和标本移动器等机械部分要灵活而不松动，如不灵活可在滑动部位滴加少许润滑油。

4.透镜表面有污垢时，可用清洁的脱脂纱布或擦镜纸，沾上少许镜头清洗液（二甲苯或石油精）揩拭，切忌用酒精，否则透镜上的胶将被溶解，而使透镜脱落。

5.用油镜观察后，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦镜纸沾少许镜头清洗液擦拭，最后用干净的擦镜纸擦干。

1.3常用仪器及其使用要领

6.当显微镜以灯泡为光源，且需要更换时，可将仪器底部翻转，抓住灯座反时针转90°取下灯座，拔下灯泡换上新的灯泡，然后把接插件卡脚对准底座上两槽口，顺时针转90°即可。

7.换保险丝时，握住保险丝座，反时针旋下保险丝座，换上好的保险丝，顺时针旋上保险丝座即可。

8.仪器长期使用后应注意在各转动部分加些润滑脂，所用油脂宜应黏度适当，避免酸性。

9.显微镜结构精密，零件不宜随意拆卸。遇故障可送厂家或有关仪器厂修理。

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1.3.2恒温培养箱恒温培养箱可分为两大类：即直热式恒温培养箱和隔水式恒温培养箱。（一）直热式恒温培养箱为直接加热空气方式的培养箱，采用“继电器控温电加热空气”技术，结构为：保温板材箱内装继电器控温电加热器。这种培养箱造价低，制造工艺简单，但恒温效果较差，温度波动大。

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（二）隔水式恒温培养箱为间接加热空气方式的培养箱，采用“继电器控温电加热水控制空气温度”技术，结构为：簿钢板外壳内衬玻璃棉，内置紫铜板水箱，水箱内装继电器控温电加热器，设双层门。这种培养箱制造工艺复杂，造价高，但由于先用电加热水层，再由水传热至箱内空气，因而温度上升和下降缓慢，加之可通过双层门的玻璃内门观察，对箱内温度影响小，故恒温效果好，调温为20～60±0.5℃，很适于微生物培养之用。见图1-2。

1.3常用仪器及其使用要领

图1-2培养箱

1.3常用仪器及其使用要领

使用注意事项：

1.箱内不应放入过热过冷的东西，以免箱内温度急剧变化，阻碍培养物的生长。

2.箱内应放入水容器一只，以维持培养箱内湿度或减少培养物中水分的大量蒸发。

3.培养箱底部因接近电源，温度较高，故培养物不宜放在底层。

4.箱内培养物不宜太挤，以免温空气不能流通，而使箱内温度不匀。

5.箱内要保持清洁，并经常用3%来苏儿液消毒，再用清洁抹布擦净。

1.3常用仪器及其使用要领

1.3.3灭菌器（一）干热灭菌箱灭菌箱正面的侧边，装有温度指针，用于定温；温度指针下面有指示灯，用于指示是否达到定温；箱内有感温探头，用于探测温度。指针、指示灯、探头、电加热器均连接于“温度调节器”，通过温度调节器使箱内保持一定温度。如温度未达定温，电加热器工作，箱内温度上升，如温度超过定温，“温度调节器”自动切断电加热器的电源，停止加热，箱内温度即可下降。

1.3常用仪器及其使用要领

图1-3干热灭菌箱

1.3常用仪器及其使用要领

使用方法：

1.适宜用干热灭菌箱灭菌的物品是玻璃器皿和金属器皿，而塑料制品、橡皮制品、天然和化学纤维制品、培养基等，均不适用干热灭菌。

2．进箱，物品放在干热灭菌箱中的铁搁板上，关箱门。

3.定温，常用灭菌温度为160℃或170℃。

4.灭菌，接通电源，干热灭菌箱升温至定温灭菌，160℃维持2h，170℃维持1～1.5h。

5.出箱，关断电源，待温度下降至50℃左右，开箱门取出被灭菌的物品。

1.3常用仪器及其使用要领

注意：

1、灭菌时，温度不宜超过170℃，以免易燃物，如棉塞、包扎纸等被烧焦。

2、高温时，切勿开箱门，以免冷空气骤然进入使灭菌的玻璃器皿炸裂。

3、绝不允许先将温度上升到100℃以上再放器皿，以免玻璃器皿骤然在高温下炸裂。干热灭菌箱用于烘干玻璃器皿时，定温120℃，持续30min即可。须打开顶部气孔，以利水蒸气散出。可启动箱内鼓风设备，加速干燥。

1.3常用仪器及其使用要领

（二）高压蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌器的灭菌效果比干热灭菌箱好，适用所有物品灭菌，通常用于培养基、生理盐水、废弃培养物、耐高热高压的药品、纱布等灭菌。高压蒸汽灭菌器有手提式、直立式和横卧式几种，它们的构造和灭菌原理是一样的，仅是容量不同而已。手提式高压蒸汽灭菌器容积最小，业务小的实验室大多使用它；横卧式高压蒸汽灭菌器容积大，只有大型实验室或生产上使用。一般实验室常使用直立式高压蒸汽灭菌器。直立式高压蒸汽灭菌器见图1-4。

1.3常用仪器及其使用要领

图1-4高压蒸汽灭菌器

1.3常用仪器及其使用要领

使用方法：

1.加水立式锅可直接加水至锅内底部隔板以下2/3高处；有加水口和水位窗者，由加水口加水至止水线处。

2.装锅把需灭菌的器物放入锅内（器物不要装得太满，以免影响灭菌效果），盖好锅盖，将螺旋柄拧紧（对角式均匀拧紧），打开排气阀。

3.点火启动开关，电加热器工作。

4.排放冷空气锅内水沸腾后，蒸汽逐渐驱赶锅内冷空气，当温度计指针指向100℃时，证明锅内已充满蒸汽，冷空气被驱尽，关闭排气阀。

1.3常用仪器及其使用要领

5.升压、保压与灭菌关闭排气阀以后，锅内成为密闭系统，蒸汽不断增多，压力计和温度计的指针上升，当压力达到0.1MPa，温度为121℃时，开始灭菌计时；控制热源，维持0.1Mpa、121℃30min即完成灭菌。

6.降压与排气完成灭菌后停止加热，任灭菌锅自然冷却降压。当压力降至0.025MPa以下后，可打开排气阀排除余汽。

7.出锅待锅内压力降至大气压时揭开锅盖，取出器物，排掉锅内剩余水。

1.3常用仪器及其使用要领

1.3.4冰箱用于储存培养基和培养物的设备，储存病毒必须使用低温冰箱，储存一般培养基和培养物用普通冰箱即可。低温冰箱整个箱壁内侧围绕冷却管，可保持－20～－70℃左右的低温。使用冰箱时，必须注意以下事项：

1.冰箱适用电压与所供电压一致。如所供电压为220V，而冰箱适用110V电压时，必须用变压器调压。

2.供电线路和保险丝满足冰箱的工作电流要求。

1.3常用仪器及其使用要领

3.使用时，应将温度调节至所需要的温度。一般应使水在冷却室中结冰，使储藏箱下部温度为5～10℃左右。

4.当冰箱冷却室结冰太厚时，会导致温度调节器的不灵敏，此时，必须停电融冰后，再投入使用。

5.冰箱门打开时间愈短愈好，打开次数越少越好。

6.不宜将温度过高的物品放入冰箱内，以免消耗电能过大、机件工作时间过长，缩短冰箱使用寿命。

7.冰箱内应保持整洁，如箱内有霉菌生长，应清洗并用福尔马林熏蒸消毒。

8.保存烈性病菌、病毒的冰箱，要专人保管，并要加锁。

1.3常用仪器及其使用要领

1.3.5水浴锅水浴箱也叫水温箱，用于融化培养基和各种保温操作。该设备是金属制成的长方形箱，箱内盛水，箱底装有电热丝，并有自动调节温度装置控制温度恒定。如图1-5所示。

1.3常用仪器及其使用要领

图1-5水浴箱

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1.3.6细菌过滤器目前常用的滤器有混合材质和全玻材质。如图1-6所示。（一）蔡氏滤器蔡氏滤器为金属制成的杯状漏斗，在杯的底部夹一层石棉滤板，滤板下有一块金属筛板，防止抽气时石棉滤板下陷。按滤孔的大小，石棉板分为三种：

1.K号，滤孔最大，可滤除一般颗粒物。

2.KK号，滤孔较小，为滤除大多数细菌。

3.EK～S号，滤孔更小，可滤除较大病毒。

1.3常用仪器及其使用要领

图1-6细菌过滤器

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（二）玻璃滤器该器组件全部为玻璃质，其中，滤板由玻璃细纱加热压成，分1、2、3、4、5、6共六级。号码愈大，孔径愈小，孔径0.15～2.0µm不等，5和6级可阻止细菌通过。玻璃滤器用后要立即处理。过滤病原微生物后的滤器，要先用不凝固蛋白质的消毒药剂浸泡3天，以免堵塞滤孔；消毒后的滤器，用蒸馏水倒抽；再在滤器内加入三分之二洗涤液，自然流出氧化残留物；再先后用自来水、蒸馏水抽吸过滤至滤液呈中性为止。

1.3常用仪器及其使用要领

如果滤器的滤孔被凝固的蛋白质颗粒堵塞，可将滤器浸泡于37℃的1%胰蛋白酶溶液（pH7.4～7.6）中消化24h，再按上法抽洗清洁。滤器为负压过滤，需要连接一抽滤瓶，将滤瓶嘴用橡皮管连接于抽气机上抽气过滤。过滤负压不宜低于（46.6～66.6）KPa（350～500mmHg），可用水银真空计指示，也可观察滤瓶内滤出液情况判断。如滤液出现大量气泡，说明负压过高，宜关闭抽气机，停止抽气，待气泡消逝后再抽。抽滤瓶的嘴应塞入少量棉花，以防放气时空气中细菌冲入瓶内。

1.3常用仪器及其使用要领

1.3.7超净工作台用于创造局部无菌环境的设备。超净工作台是一个由预过滤器、高效过滤器、空气幕风机有效排除空气中的悬浮灰尘、微生物，由紫外灯或喷雾灭菌，装有照明灯、操作台面板、配电装置，并有消音、减震设备的箱体，如图1-7所示。超净工作台是没有建设无菌室的微生物实验室的必备设备，也可用于有更严格无菌要求或其他小环境条件要求的微生物接种、分离和鉴定等操作。

1.3常用仪器及其使用要领

图1-7超净工作台

1.3常用仪器及其使用要领

使用超净工作台应注意以下几点：

1．清除工作台内的灰尘、杂物。

2．在使用超净工作台进行无菌操作前30min启动过滤、通风装置，检测操作区气流速度、洁净度，并灭菌。

3．穿紧口工作服，戴紧口帽。

4.严禁在超净工作台前做任何可能增加空气灰尘量的动作。

5.必须在超净工作台内使用的物品要放在下风侧。

6.在超净工作台内使用的物品必须是不易起纤尘的。

7.在全部无菌操作结束后，才能停止工作台运转。

8.定期进行性能检测。

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1.3.8电动抽气机电动抽气机又叫真空泵，由电动机转轮、轮带和偏心轮等组成。通电后，电动机带动偏心轮，即可将与其相关的容器内的空气抽出。如图1-8所示。电动抽气机主要供细菌过滤器、厌氧培养、培养基过滤和真空干燥时抽气用。使用抽气机时，应注意以下事项：

1.抽气机的适用电压要与所供电压一致，否则，要经变压器变压后才能使用。

1.3常用仪器及其使用要领

2.要保持机油箱内的油量，防止机器损坏。

3.必须使用硬质的连接管，保证气路畅通以确保器皿内抽真空效果。

4．被抽气的器皿，必须有良好的抗压性能，以防内部真空后被外部空气破碎。

5．如果在抽滤过程中滤液出现大量气泡，可以暂时停机，待气泡消失后，再开机继续抽气。

6．如果要作冷冻干燥，则需用精密度高、功率大的抽气机。

1.3常用仪器及其使用要领

图1-8电动抽气机

1.3常用仪器及其使用要领

1.3.9电动离心机离心机为进行病菌病毒检验鉴定中不可缺少的工具。离心机的种类很多，实验室常用小型倾斜电动离心机。小型倾斜电动离心机机顶正中有孔盖，以便放入和取出离心试管，内有离心管座四或六个，均匀地绕离心轴排列，底座上装有开关和调速器。如图1-9所示。

1.3常用仪器及其使用要领

图1-9小型倾斜电动离心器A-离心机断面1.转速调节器2.电动机3.金属套管4.护盖5.玻管；B-离心器全形6.盖

1.3常用仪器及其使用要领

使用离心机时应注意：

1.应放在平稳的地方，并保持水平。

2．将装有标本的离心试管放入离心管座的金属套管内，两两成对，每个重量基本平衡。

3．放好试管后，盖上孔盖。

4．开启电源开关，先用最低转速，逐渐调节到最高转速。

5.达到离心时间后，逐步降低转速，待降到最低转速后，关闭电源开关。

6．待离心机自然停止转动，打开孔盖，取出离心试管。

7.离心试管须加棉塞时，离心前应将棉塞上端用橡皮圈扎紧在试管外或用大头针别住，以免离心时棉塞沉入管内。

8.应经常保持转轴润滑。

1.3常用仪器及其使用要领

1.3.10天平

(一)粗天平粗天平又称工业天平或药物天平，是用于粗略称量的仪器。常用的有100g、200g、500g、1000g四种，感量为千分之一，供配制普通试剂和粗略称量之用。

(二)电子天平这类天平只有一个盘，构造比一般天平复杂，但使用起来却十分方便。返回1.4常用器皿

名称规格试管18×180mm，15×150mm，10×100mm，还有反应管(杜氏小管)，以厚管壁为宜培养皿常用的培养皿直径为900mm，高为15mm吸管0.1mL，0.2mL，0.5mL，1.0mL，5.0mL，10.0mL的刻度吸管量筒10.0mL，50.0mL，100mL，500mL，1000mL漏斗直径3.0cm，6.0cm，10.0cm烧杯50mL，100mL，250mL，500mL，800mL，1000mL容量瓶各种容量试剂瓶各种容量(白色和棕色)滴瓶一般用125mL(白色和棕色)载玻片2.5cm×7.5cm，厚0.01～0.13cm盖玻片1.8cm×1.8cm，厚0.17cm干燥器不同直径的普通干燥器1.4.1常用的玻璃器皿微生物实验室常用的玻璃器皿见表1-1所示。表1-1常用的玻璃器皿1.4常用器皿

1.4.2常用的玻璃器皿的洗涤与消毒微生物学实验中常用的培养皿、试管和三角瓶等的洗涤、消毒质量，直接影响实验结果，因此，这项工作不容忽视。（一）新玻璃器皿的洗涤法新购置的玻璃器皿含有游离碱，应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，再用水充分冲洗干净。1.4常用器皿

（二）含有琼脂培养基的玻璃器皿的洗涤法先用小刀或铁丝将器皿中的琼脂培养基刮下。如果琼脂培养基已经干燥，可将器皿放在水中蒸煮，使琼脂熔化后趁热倒出，用水洗涤，并用刷子沾肥皂擦洗内壁，然后用自来水洗去肥皂。是否已将油垢完全除去，可以这样检查：即将瓶子或试管的外壁擦干，如果水在内壁是均匀地分布一薄层，可以认为是将油垢除去了。如果经过这样洗涤的器皿，油垢还未洗净，就需用洗涤液来清洗。

1.4常用器皿

（三）载玻片及盖玻片的洗涤法新载玻片和盖玻片先在2%的盐酸溶液中浸1h，以后用自来水冲洗2～3次，最后用蒸馏水换洗2～3次。也可用1%的洗衣粉洗涤，新载玻片用洗衣粉洗涤时，先将洗衣粉液煮沸，然后将要洗的新载玻片散入煮沸液中，持续煮沸15～20min(注意煮沸液一定要浸没玻片，否则会使玻片钙化变质)，待冷后用自来水冲洗至中性。新盖玻片用洗衣粉洗涤时，将盖玻片散入1%的洗衣粉液中，煮沸lmin，待沸点泡平下后，再煮沸1min，。1.4常用器皿

1.4.3常用的玻璃器皿的包装玻璃器皿使用前必须经过灭菌，而灭菌前应预先将玻璃器皿包装好。（一）棉塞的制作常见的做法有：将棉花铺成方形，对角方向不完全对折，垂直于对折线方向卷起来，如图1-10所示；或将棉花铺成方形，于其中央衬以小块棉花，再将四边棉花包拢。制作好的棉塞最好用纱布包好，以利于使用和保存。另外，也可根据需要，购买市售的泡沫塑料塞。1.4常用器皿

图1-10棉塞的制作过程1.4常用器皿

制作质量好的棉塞的形状、大小、松紧，应与试管口(或三角瓶口)完全适合。过紧会妨碍空气流通，不便塞拔，过松则达不到滤菌的目的。棉塞过大，塞不进试管口(或三角瓶口)，过小则容易掉进试管内。正确的棉塞，塞头较大，约占棉塞总长的1/3，留在管外，塞体约占棉塞总长的2/3，塞在管内，如图1-11所示。棉塞应塞在试管内，用报纸或牛皮纸包装后一道灭菌。

1.4常用器皿

图1-11试管帽和棉塞1.试管帽；2.正确的棉塞；3.4.不正确的棉塞1.4常用器皿

（二）吸管的包扎将非脱脂棉塞入管尾，长度约2cm，后端距尾口1.5cm，松紧要适当，以吹气时通气流畅而不滑动为度。将吸管尖端以30゜角放在宽4～5cm、长55cm的纸条(报纸或牛皮纸)的一端，折返纸头包住管尖后，以螺旋形式包裹吸管，将包裹卷紧的纸棒在管尾端打一个结，以防吸管脱出。如图1-12所示，包好后等待灭菌。

1.4常用器皿

图1-12单支刻度吸管的包扎1.4常用器皿

（三）培养皿的包扎培养皿可按4套或8套为一叠，用纸包扎好，如图1-13所示，待灭菌。或直接将培养皿装入金属筒内进行干热杀菌。

图1-13培养皿的包扎

返回1.5小型微生物厂主要仪器及设备

小型微生物厂的主要仪器及设备见表1-2。表1-2小型微生物厂的主要仪器及设备一览表名称数量规模制造材料备注无菌柜1长110—120厘米，宽80厘米，高70厘米摇瓶机1往复式或旋转式，能放500mL三角瓶20个钢木须放在恒温室内显微镜1放大1000—1500倍须带血球计数板，载玻片和盖玻片分析天平11/1000恒温箱1100×130×80cm可自制电冰箱1恒温干燥箱1鼓风机种子罐2立式圆筒形蝶底盖具夹套及搅拌发酵罐3立式圆筒形蝶底盖具夹套及搅拌1.5小型微生物厂主要仪器及设备

空压机2固定水冷式压力2～3kg/cm2，风量0.4m3/min两台轮换使用总空气过滤器2立式圆筒形φ360×1200钢锅炉1蒸发量0.3吨／时，压力4公斤／厘米2消毒柜1柜式容积1米3钢每4小时消一柜，每柜400斤，每日两班其他温度表、酒精灯、小天平、试管、试管架(自制)、漏斗架、吸管(毫升)、三角瓶、培养皿、烧杯、量筒、玻璃棒、牛皮纸、夹子、小骨勺，橡皮管，紫外线、钟表，石棉网、洗瓶刷等。表1-2(续)小型微生物厂的主要仪器及设备一览表

微生物的鉴定

1微生物的形态观察一、实验目的

1.学习微生物涂片、染色的基本技术。

2.掌握微生物的简单染色法。

3.熟悉细菌、放线菌、酵母菌、霉菌在形态上的主要区别。二、实验原理微生物的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助于染色，使菌体着色以增加菌体的显示力，从而更清楚地观察到其形态和结构。

1微生物的形态观察在微生物形态观察中，根据不同的种类，需采用不同的染液和染色方法。染色前必须固定微生物，其目的有二：一是杀死微生物并使菌体粘附于载玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法，固定时应尽量维持细胞的原有形态，防止细胞膨胀或收缩。

1微生物的形态观察微生物类群细菌放线菌酵母菌霉菌菌种大肠杆菌细黄链霉菌米酒酵母根霉染液番红石炭酸复红吕氏美兰乳酸石炭酸棉蓝三、实验材料

1.菌种与染料根据不同的菌种采用不同的染液，见表3-1和附录Ⅳ。

2.仪器和其他用品显微镜，接种环，解剖刀，镊子，酒精灯，载玻片，盖玻片，石蜡油，吸水纸，擦镜纸。表3-1不同微生物种类所使用的染液

1微生物的形态观察四、实验方法（一）细菌、酵母菌的染色染色操作程序为：涂片——干燥——固定——染色——水洗——干燥——油镜观察。

1.涂片取干净载玻片，于中央加蒸馏水一小滴，将接种环在火焰上灼烧灭菌，冷却后，取试管斜面一支，按无菌操作法用接种环从菌种斜面表面挑取细菌少许(注意不要挑破培养基)，涂在载玻片水滴中，涂面约为1cm2的均匀薄膜。如果是液体培养物则不必加水，直接取菌液1～2环涂片，接种环经灭菌后放回原处。无菌操作及做涂片的过程见图3-1。

1微生物的形态观察图3-1无菌操作及做涂片的过程

1微生物的形态观察

2.干燥将涂片自然风干或将载玻片置于酒精灯火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。

3.固定手执涂片一端，有菌膜的一面向上，迅速通过火焰2～3次，使菌体固定于载玻片上，待载玻片冷却后，再加染料。

4.染色将涂片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜为度)番红染液或吕氏美兰染液于菌膜部位，染色1～2分钟。

5.水洗倾去染色液，用洗瓶中的自来水自载玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。

6.干燥和镜检让其自然干燥或用吸水纸吸去载玻片上多余的水分后。先用低倍镜找到物像后再用油镜观察。

1微生物的形态观察（二）放线菌、霉菌的染色

1.制片及染色用解剖刀从菌落的边缘连同培养基一起挑取少量带有孢子的菌丝，置于载玻片中央，先用另一载玻片使劲挤压有菌部分，使得菌群铺成一薄层，然后将载玻片中央置于酒精灯火焰上方加热，使培养基融化，冷却后，在载玻片的中央有菌部分滴加2滴石炭酸复红或乳酸石炭酸棉蓝染液，再轻轻盖上盖玻片，注意避免产生气泡。

2.镜检先用低倍镜观察，再换高倍镜观察。五、实验报告绘出所观察到的各种微生物的形态。返回

2细菌特殊结构的观察

一、实验目的

1.掌握芽孢染色的方法；

2.学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征；

3.学习并掌握荚膜染色的基本方法。二、实验原理细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，着色、脱色都比营养细胞困难。芽孢染色法就是根据这一特点设计的：采用一着色力强的染料，并用微火加热，使菌体和芽孢同时着色后再用水洗，使菌体脱色而芽孢仍保留已着的颜色。

2细菌特殊结构的观察

细菌的鞭毛极细，其直径通常为10～20nm，只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。其基本原理是在染色前先用媒染剂处理，使媒染剂沉积在鞭毛上，鞭毛直径加粗，然后再进行染色。荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖、糖蛋白或多肽，荚膜与染料之间的亲和力弱，不易着色，且可溶于水，易在水洗时被除去。但荚膜的通透性较好，一些染料可透过荚膜而使菌体着色，故常采用负染色法，使菌体和背景着色，荚膜不着色；因而荚膜在菌体周围呈一透明圈。荚膜很薄，含水量又高(90%以上)，故染色时不用热固定，以免荚膜皱缩变形。

2细菌特殊结构的观察

观察目的芽孢鞭毛荚膜实验菌种枯草芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌褐球固氮菌三、实验材料

1.菌种根据观察目的的不同，选用不同的实验菌种，见表3-2。

2.染料及试剂孔雀绿染色液，硝酸银鞭毛染色液，黑色素水溶液（见附录Ⅳ），番红溶液，甲醇。

3.仪器和用品显微镜，木夹子，载玻片，酒精灯等。表3-2细菌特殊结构观察所选用的菌种

2细菌特殊结构的观察

四、实验方法（一）芽孢的染色

1.涂片取培养24h左右的枯草杆菌，涂片、干燥、固定。

2.初染加3～5滴孔雀绿染色液于已固定的涂片上，用木夹夹住载玻片，用微火加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。加热中应随时注意补加染液，切勿使标本干涸。

3.水洗待玻片冷却后倾去染液，水洗至不再褪色为止。

4.复染加番红液1滴，染色1min，水洗。

5.镜检干燥后用油镜观察。

2细菌特殊结构的观察

（二）鞭毛染色

1.菌种的准备冰箱保存的菌种要连续移种1～2次，取新配制的营养琼脂斜面接种，28～32℃培养10～14h。

2.载玻片的准备玻片要求光滑，洁净，忌带油迹。将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20min，取出用清水充分洗净，沥干水后置于95%乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。

3.菌液的制备取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1～2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。

2细菌特殊结构的观察

4.制片取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温(或37℃温箱)自然干燥。

5.染色涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液。用B液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。

6.镜检干后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色，通常呈波浪形。

2细菌特殊结构的观察

（三）荚膜染色

1.制片在载玻片一端加一滴无菌水溶液，取少许培养72h的褐球固氮菌，在水滴中制成菌悬液，取一滴碳素绘图墨水与菌悬液充分混匀。另取一块载玻片作推片，将推片一端平整的边缘与菌液以300角接触后顺势将菌液拉向前方，使其涂成一薄膜，风干。

2.固定用纯甲醇浸没涂片，固定1min，立即倾去甲醇，文火干燥，勿使玻片发热。

3.染色滴加番红溶液，染色1～2min，细水流适当冲洗，自然干燥。

4.镜检背景黑灰色，荚膜呈一清晰透明圈，菌体红色。

2细菌特殊结构的观察

五、实验报告

1.绘图表示枯草芽孢杆菌茵体的形状与芽孢的形状、大小及其着生位置。

2.绘图表示有鞭毛细菌的形态特征。

3.绘图说明你观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。返回

3革兰氏染色法

一、实验目的

1.了解革兰氏染色的原理。

2.掌握革兰氏染色的方法。二、实验原理革兰氏染色法是细菌学中的一个重要的鉴别染色法。由于应用了结晶紫和番红两种不同性质的染料进行染色，故又叫复染色法。根据细菌对此种染色法的反应不同，可将细菌分为两大类，菌体呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为革兰氏阴性菌。

3革兰氏染色法

其原因是由于这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，交联度大，类脂质含量低，经用乙醇（或丙酮）脱色等处理主要发生脱水作用，而使孔径缩小，通透性降低，初染剂结晶紫和媒染剂碘的复合物保留在细胞内不被脱色，结果使细胞呈紫色；而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，类脂含量高，当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫和碘的复合物较容易被洗脱出来，用番红复染后，细胞被染上红色。

3革兰氏染色法

三、实验材料

1.菌种大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。

2.染料和器材显微镜，载玻片，草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液（见附录Ⅳ），95%乙醇，番红染液，香柏油，二甲苯，擦镜纸。

3革兰氏染色法

四、实验方法

1.涂片挑取少许大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，分别涂片(涂片一定要非常薄)。也可采用“三区”涂片法：在玻片中央偏左和偏右方各加一滴无菌水，先挑取少量的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在左右一方分别涂片后，再将左右方的菌液延伸于中间区，使大肠杆菌、金黄色葡萄球菌相互混合。

2.干燥室温自然干燥。

3.固定涂面朝上，在火焰上过2～3次。

3革兰氏染色法

4.染色(图3-3)

(1)初染加草酸铵结晶紫染色液一滴，染色1～2min，水洗。

(2)媒染滴加卢戈氏碘液冲去残水，覆盖约1min，水洗。

(3)脱色斜置玻片于一烧杯上方，并在载玻片背面衬一白纸，滴加95%乙醇脱色，并轻轻摇动载玻片，直洗至流出的乙醇刚刚不出现紫色时即停止(约0.5min)。立即用水洗净乙醇，并轻轻吸干。

(4)复染加番红染液一滴染色2min，水洗。

3革兰氏染色法

实验图3-3革兰氏染色程序1.加草酸铵结晶紫染1～2分钟；2.水洗；3.加碘液媒染1分钟；4.水洗；5.乙醇脱色约30s；6.水洗；7.番红复染约2分钟；8.水洗。

3革兰氏染色法

5.干燥先用吸水纸轻轻吸干，再晾干。

6.镜检先用低倍镜找到物像后，用油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。五、实验报告简述观察到的两种细菌革兰氏染色的结果并绘图（说明各菌的形态、颜色和革兰氏染色反应）。返回

4微生物的大小测定与计数

一、实验目的

1.了解用测微尺测定微生物大小的方法；

2.了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法。二、实验原理微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一。由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是一块圆形的玻片，在载玻片中央有一条把5mm长度刻成50等分或把10mm长度刻成100等分的线(图3-2)。

4微生物的大小测定与计数

测量时，将其放在接目镜隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物像。目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数的不同而异。即目镜测微尺上的刻度只是代表相对长度，所以在使用前须用镜台测微尺校正，以求得在一定放大倍数下实际测量时的长度。镜台测微尺是一个中央部分刻有一条长为lmm刻度的载玻片(比一般载玻片厚)，其上镶有一圆形玻片，其中lmm的刻度被精确等分为100小格，每格长0.01mm(图3-3)。因此长度固定不变，所以用镜台测微尺的已知长度，在一定放大倍数下，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度(图3-4)。

4微生物的大小测定与计数

图3-2目镜测微尺图3-3镜台测微尺图3-4镜台测微尺校准目镜测微尺情况

4微生物的大小测定与计数

血球计数板可用于计数一定体积内的微生物个体数量。血球计数板是一块特制的载玻片，玻片上有4条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表面比两个平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央lmm2面积上刻有400个小方格(见图3-5)。

4微生物的大小测定与计数

图3-5血球计数板的构造

1-盖玻片2-计数室

4微生物的大小测定与计数

血球计数板有两种规格，一种是将lmm2面积分为25个大格，每个大格再分为16个小格(25×16)。如在血球计数板上刻有一些符号和数字(见图3-5a)，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25大格：即0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；(1/400)mm2表示计数室面积是lmm2，分400个小格，每小格面积是(1/400)mm2。另一种是16个大格，每个大格再分为25个小格(16×25)。两者都是总共有400个小格。当专用盖玻片置于两条嵴上，从两个平台侧面加入菌液后，400个小方格(1mm2面积)计数室上形成0.1mm3(10-4mL)的体积。通过对一定大格内微生物数量的统计，可计算出lmL菌液所含的菌体数(见图3-6)。

4微生物的大小测定与计数

图3-6两种不同刻度血球计数板的构造

4微生物的大小测定与计数

三、实验材料

1.标本酿酒酵母，枯草杆菌染色标本片。

2.仪器和用品显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板，移液管，香柏油，二甲苯，盖玻片，擦镜纸等。四、实验方法（一）微生物大小的测定

1.目镜测微尺的校正（1）将目测微尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下；（2）把物测微尺放在载物台上，使刻度朝上，对准聚光器。

4微生物的大小测定与计数

（3）先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后转换高倍镜，再次调焦看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺的第一条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。（4）记录两端重合线之间目镜测微尺和镜台测微尺各有若干格。各种放大倍数各测量3次，取其平均值。（5）因为镜台测微尺的刻度每格10µm，所以由下式计算出用低倍镜、高倍镜和油镜观察物体时，目镜测微尺每格的实际长度。

4微生物的大小测定与计数

（6）移去镜台测微尺，并将其洗净、晾干，放回盒内。

例如，目镜测微尺5小格等于镜台测微尺2小格，则目镜测微尺上每小格长度为：2×10／5=4µm

用同法校正在油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度)进行，而且只能在特定的情况下重复使用。

4微生物的大小测定与计数

2.菌体细胞大小测定

(1)取一张干净的载玻片，滴上一滴棉兰染色液或路戈氏碘液。

(2)用接种环无菌操作取酵母菌少许制成水浸标本片。

(3)取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长、宽各占几格(不足1格的部分估计到小数点后l位数)。测出的格数乘上目镜测微尺每格代表的长度即等于该菌的大小。

4微生物的大小测定与计数

一般测量菌体的大小要在同一涂片上测定10～15个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小，而且是用对数生长期的菌体进行测定。

3.用同法在油镜下测定枯草杆菌染色标本的长和宽。

4.用毕后，取出目镜测微尺，将目镜放回镜筒，用擦镜纸擦去目镜测尺的油腻和手印，擦好油镜头。

4微生物的大小测定与计数

（二）微生物的计数

1.稀释样品，为了便于计数，将样品适当稀释，使每格约含4～5个细胞。

2.取干净的血球计数板，用厚盖玻片盖住中央的计数室，用移液管吸取少许充分摇匀的待测菌液于盖玻片的边缘，菌液则自行渗入计数室，静置5～10min即可计数。

3.将血球计数板置于载物台上，用低倍镜找到小方格网后换高倍镜观察计数。需不断地上、下旋动微调节器，以便看到计数室内不同深度的菌体。

4微生物的大小测定与计数

现以16×25规格的计数板为例，数四个角（左上、右上、左下、右下）的四中格（即100小格）的酵母菌数。如果是25×16规格的计数板，除取四个角上四中格外，还取正中的一个中格（即80小格），对位于大格线上的酵母菌只计大格的上方及左方线上的酵母菌，或只计下方及右方线上的酵母菌。每个样品重复计数3次，取平均值，再按公式计算每毫升菌液中所含的酵母菌数。酵母菌细胞数/mL=每个小格内细胞数×400×104×稀释倍数

4微生物的大小测定与计数

五、实验报告

1.将实验结果填入下列空格目镜______倍，低倍镜______倍，高倍镜__

__，油镜

倍。高倍镜下，目镜测微尺_________格：镜台测微尺_______格。目镜测微尺每格=_____µm。油镜下，目镜测微尺______格＝镜台测微尺________格。目镜测微尺每格=____µm。

2.将测得的菌体大小记录于下表3-3中

3.将计数得的菌体数量记录于下表3-4中

4微生物的大小测定与计数

菌号12345678910平均值（μm）长(格）宽(格）计数次数左上角方格左下角方格（中央方格）右上角方格右下角方格合计平均每个小格内细胞数123稀释倍数酵母菌细胞数／mL表3-3菌体大小测量结果表3-4菌液中所含的酵母菌数返回

5微生物的理化性能鉴定

一、实验目的

1.了解细菌鉴定中常用的生化反应及其原理。

2.了解不同种类的细菌对碳水化合物及含氮化合物的分解利用情况，从而认识微生物代谢类型的多样性。

3.学习平板接种法及穿刺接种法。二、实验原理由于各种微生物的新陈代谢不同，因此对各种物质利用后所产生的代谢产物也不同，故可利用化学反应来测定微生物的代谢物（这种反应称为生化反应），并以此作为鉴定微生物的依据。

5微生物的理化性能鉴定

三、实验材料

1.菌种枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，产气杆菌，普通变形杆菌。

2.培养基淀粉培养基，葡萄糖蛋白胨培养基，蛋白胨水培养基，柠檬酸铁铵固体培养基等，见附录Ⅲ。

3.试剂卢戈氏碘液，40%NaOH溶液，5%

-萘酚溶液（乙醇配制），甲基红试剂，吲哚试剂（见附录Ⅴ），乙醚等。

4.其他物品无菌培养皿，无菌试管，接种环，酒精灯，接种针等。

5微生物的理化性能鉴定

四、实验方法

(一)淀粉水解试验某些细菌可以产生淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。操作步骤如下：

1.将盛有淀粉培养基的锥形瓶置于沸水俗中融化，然后取出冷却至50℃左右，以无菌操作倾入培养皿中约15～20mL，待凝固后制成平板。

2.翻转平皿使皿底朝上，用记号笔在其背面做好标记，以免菌种混淆。

5微生物的理化性能鉴定

3.用接种环取少量枯草芽孢杆菌在平板的一边划“+”字作为阳性对照菌；另取少量大肠杆菌或产气杆菌在平板的另一边划“+”字（图3-7），然后将培养皿倒置于37℃恒温箱中培养24h。

4.观察结果打开培养皿盖，滴加少量碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板，如菌体周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱。

5微生物的理化性能鉴定

12图3-7淀粉水解试验接种示意图

1.枯草芽孢杆菌；2.大肠杆菌

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(二)乙酰甲基甲醇(V.P.)试验某些细菌在糖代谢过程中，能分解葡萄糖产生丙酮酸，二个分子丙酮酸经缩合和脱羧生成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化成二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基起作用，生成红色化合物。此为V.P.试验的阳性反应。在试管中加入少量的

-萘酚为颜色增强剂可使反应加快。

5微生物的理化性能鉴定

操作步骤如下：

1.分别接种大肠杆菌和产气杆菌于装有葡萄糖蛋白胨培养基的试管中，置于37℃恒温箱内培养24～48h，有时需延长培养到10天。

2.在已培养两天的试管内，先加入40%KOH溶液10～20滴，然后再加入等量的

-萘酚溶液，拔去棉塞用力振荡，再放入37℃恒温箱中保温15～30min(或在沸水浴中加热1～2min)。如培养液出现红色为V.P.阳性反应。

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(三)甲基红(M.R.)试验有些细菌在糖代谢过程中，可把培养基中的糖分解为丙酮酸，丙酮酸再被分解为甲酸、乙酸、乳酸等。酸的产生可由加入甲基红指示剂的变色而指示。甲基红的变色范围pH4.2(红色)～pH6.3(黄色)。操作步骤如下：

1.取葡萄糖蛋白胨培养液两支，一支接入大肠杆菌，另一支接入产气杆菌，置37℃恒温箱内培养48h。

2.观察结果时，沿管壁加入甲基红指示剂3～4滴，若培养液变红色即为阳性，变黄色则为阴性。

5微生物的理化性能鉴定

(四)吲哚试验有些细菌能氧化分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚无色，可与对二甲基氨基苯甲醛结合，生成红色的玫瑰吲哚。操作步骤如下：

1.以无菌操作分别将产气杆菌和大肠杆菌接种在蛋白胨水培养中，置37℃恒温箱内培养48h。

2.观察结果时，在培养液中加入乙醚1～2mL（使呈明显的乙醚层），充分振荡，使吲哚被溶于乙醚中，静置片刻，使乙醚层浮于培养基的上层，然后沿试管壁加入10滴吲哚试剂，如果有吲哚产生，则乙醚层呈现玫瑰红色。

5微生物的理化性能鉴定

(五)H2S产生试验某些细菌能分解含硫有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐等，会形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀。操作步骤如下：

1.取2支柠檬酸铁铵固体培养基，分别用穿刺接种大肠杆菌和普通变形杆菌，置37℃恒温箱内培养48h。

2.观察结果，如培养基中出现黑色沉淀线者为阳性反应，同时注意观察接种线周围有无向外扩展情况，如有表示该菌具有运动能力。

5微生物的理化性能鉴定

试验名称菌种淀粉水解试验V．P．试验M．R．试验吲哚试验硫化氢产生试验大肠杆菌产气杆菌普通变形杆菌枯草芽孢杆菌五、实验报告将实验结果填入下表3-5。“＋”表示阳性反应，“－”表示阴性反应。表3-5微生物的理化性能鉴定结果

微生物检验技术

1食品中细菌总数测定一、实验目的了解食品中细菌的检测方法。二、实验原理菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等)，所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。

1食品中细菌总数测定三、实验材料

1.器材恒温培养箱，冰箱，天平，电炉，恒温水浴锅，培养皿，lmL和l0mL吸管，500mL三角瓶，玻璃珠，培养皿，试管，酒精灯，试管架，灭菌刀或剪刀，灭菌镊子，酒精棉球。

2.用品市售饮料，牛肉膏蛋白胨培养基，75％乙醇，生理盐水或其它稀释液定量分装于三角瓶和试管内灭菌。

1食品中细菌总数测定四、实验方法菌落总数的检验程序见图7-1所示。

(一)检样稀释及培养

1.以无菌操作，将饮料检样25mL放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)内，经充分振摇制成1∶10的均匀稀释液（如为固体检样最好用均质器，以8000～10000r/min的速度处理1分钟，作成1∶10的均匀稀释液）。

2.用lmL灭菌吸管吸取1∶10稀释液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，作成1∶100的稀释液。

1食品中细菌总数测定图7-1菌落总数检验程序

1食品中细菌总数测定

3.另取lmL灭菌吸管，按上项操作顺序，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支lmL灭菌吸管，直至稀释到所需浓度。

4.根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度分别用吸取该稀释度的吸管移lmL稀释液于灭菌皿内，每个稀释度作两个平皿。

5.稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基(可放置46℃水浴保温)注入平皿约15mL，并转动平皿混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有lmL灭菌水(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。

6.待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养24±2小时。

1食品中细菌总数测定

(二)菌落计数方法作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。

(三)菌落计数的报告

1.平板菌落数的选择选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板的平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌