研究生专业技能训练-唐雪

RNA提取及PT-PCR技术研究生分子生物学实验唐雪食品营养与功能因子研究中心D117Tel:85917780E-mail:基因表达(GeneExpression)

细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。

对这个过程的调节即为基因表达调控(RegulationofGeneExpressionorGeneControl)。

①转录水平上的调控；

②mRNA加工、成熟水平上的调控；

③翻译水平上的调控

Gene(DNA)TranscriptionmRNAProteinCellularFunctionTranslationmRNA每一个真核细胞约含5-10μgRNA80-85%是rRNA〔主要是28S、18S和5SrRNA〕10-15%tRNA和核内小分子RNA1-5%的mRNA

分子量不均一3´末端有polyA组成的尾，利用寡聚〔dT〕亲和层析柱别离提取高纯度完整的RNA，是研究基因表达、体外转录、构建cDNA文库、RT-PCR、Northern杂交的重要根底环节实验安排第一次课〔全天〕实验一小鼠肝脏总RNA提取〔上午〕实验二PCR技术扩增特异性DNA片段〔一〕〔下午〕第二次课实验二PCR技术扩增特异性DNA片段〔二〕实验一小鼠总RNA提取TRIzol法TRIzol中含有RNase抑制剂〔异硫氰酸胍、β-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠〕增强核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白别离在参加氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无蛋白和DNA的水相中，容易被异丙醇沉淀异丙醇使RNA沉淀浓缩本卷须知实验成败的关键：严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性全部实验过程中均需戴手套〔使用一次性手套〕、口罩操作所用的玻璃器皿、塑料容器等均需进行处理前方可使用〔详见本卷须知〕实验所用试剂可用含有0.1%DEPC121℃高压灭菌处理后的水配置实验步骤1.动物在实验前禁食8-10小时。取100mg新鲜肝组织加1mLTRizol〔预冷〕试剂，于冰浴匀浆，匀浆速度要快，使肝组织迅速接触到变性剂，防止组织内源RNA酶的污染。然后将匀浆液转移至1.5mL离心管中，室温静置10min；注意：高蛋白，脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4℃12000离心10min去掉不溶物，再进行后面操作。2.参加200uL〔或1/5体积〕氯仿，充分混合30s，室温静置5min，分层。4℃12000rpm离心15min，离心管中液体分为3层：上层为水相，RNA在此相中，蛋白质在下层黄色的有机相中，DNA保存在上下两层的界面处的中间层；3.小心吸取上层水相约0.4mL〔或<0.4mL〕于新的塑料离心管中〔切勿吸取中间层和下层液体〕。参加等体积的4℃预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置20min〔或-20℃静置30min以上〕；4.4℃12000rpm离心15min，沉淀RNA，弃上清；5.用1mL预冷的75%乙醇〔DEPC水配制〕洗涤沉淀，12000rpm4℃离心10min，弃尽上清；6.重复步骤5，然后室温中自然枯燥约10min，至RNA呈半透明状即可(用10µl枪小心吸取多余乙醇)；7.根据RNA提取量加20-100µLDEPC〔50µL〕处理的水溶解沉淀，56℃水浴10min，立即置于冰上，得到所提取的RNA溶液；8.如须保存，可加0.1体积的3M醋酸钠〔pH5.2〕和2.2倍体积的冰无水乙醇，充分混匀，于-70℃低温保存。或用稳定的甲酰胺溶〔4mg/mL〕,-20℃保存，用时，4倍乙醇沉淀，回收RNA。RNA纯度、浓度测定及分子完整性的鉴定RNA是否能用于后续实验，取决于它的纯度和分子的完整性，常用的鉴定方法是测定样品260nm与280nm的光吸收值以及电泳显示RNA分子是否降解。1.260nm/280nm光吸收比值取10µL总RNA样品，加990µLDEPC水〔配2mL〕，混匀，测同一样品在260nm和280nm光吸收值〔A260和A280〕2.计算RNA纯度=A260/A280比值范围<1.8，RNA样品有蛋白质或酚〔苯环物质〕污染，需要用氯仿重新抽提。>2.0，核苷酸降解RNA浓度〔µg/mL〕=A260×40×〔1/光径〕×稀释倍数〔100倍〕提取的RNA浓度约1-5µg/µL为宜RNA电泳〔甲醛变性凝胶电泳〕RNA提取的成功与否是RT-PCR检测中最重要的步骤用途:

检测细胞中基因表达水平检测基因表达细胞中RNA病毒的含量直接克隆特定基因的cDNA序列注意问题：mRNAcDNAOligodT,逆转录酶特异性引物,Taq酶PCRRNA的反转录〔RT〕和cDNA的聚合酶链式扩增〔PCR〕相结合的技术模板RNA：总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物实验二PCR技术扩增特异性DNA片段(RT-PCR)适用于mRNA表达量解析•TwoStepRT--PCR效率高•使用Random和Oligo--dT引物可以制备cDNApool•cDNA可长期保存TwoStepRT--PCR1.逆转录(RT)第一步〔10µL〕RNA(1ug/uL)2uLdNTP(10mM)2uLOligo(0.5ug/uL)2uLDEPC水4uL①70℃,5min②4℃5×buffer5uLRnaseI(40u/uL)0.2uLM-MLV(200u/uL)0.5uLDEPC水9.3uL①37℃,1h②95℃,5min③4℃(或-20℃长期保存)第二步〔15µL〕1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸③高温变性①低温退火②重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍2.PCRtext1tex2text3标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L10×扩增缓冲液H2OPCR的根本原理PCR反响条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA94℃50℃PCR的根本原理PCR反响条件PCR过程PCR的特点56℃引物1引物2DNA引物72℃PCR的根本原理PCR反响条件PCR过程PCR的特点72℃引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶95℃PCR的根本原理PCR反响条件PCR过程PCR的特点94℃第1轮结束第2轮开始56℃72℃PCR的根本原理PCR反响条件PCR过程PCR的特点72℃TaqTaqTaqTaqPCR的根本原理PCR反响条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的根本原理PCR反响条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR产物生成曲线log[DNA]CyclesPCR琼脂糖凝胶电泳最终产物紫外光观察3-4小时2.基因扩增〔β-actin〕5×buffer2.5uLdNTP（2.5mM）2uLMg2+1.5uL上游引物

（10pM）2uL下游引物(10pM)2uLcDNA2uLTaq酶（4u/uL）0.1uLH2O

13.4uL34Cycle94℃5min,

94℃30s,55℃30s,72℃1min,72℃10min,4℃

34循环PCR具有极高的灵敏度样品正对照负对照标准分子量污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。用紫外灯破坏污染物也是一个方法text1text2text3不同样品有不同的生成曲线log[DNA]Cycles举例内参选定，共同扩增－原理：PCR反响体系中参加荧光基团，利用荧光信号积累实时监控PCR整个进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析Ct值2.Real-TimePCR〔实时定量〕－用途：组织的基因表达分析，应用非常广泛－优点：灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反响、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点Cycle1Cycle3Cycle2SYBRgreen①SYBRgreen作用原理MolecularProbe公司的一个专利产品，USPatent5,436,134,1993年7月12日申请SYBRgreen的优缺点简便可以使用已有的引物普遍通用可以检测所有的双链DNA，包括引物二聚体需要化大力气优化反响条件，以消除非特异性扩增价格$1/PCR反响定量的灵敏度有所欠缺②TaqMan体系ABI公司首先推出(PRISM7000系列)USPatent5,723,591,1995年11月申请。实时检测:

每个循环都会产生与P