微生物工程工艺原理 第五章 氨基酸发酵机制

第五章氨基酸发酵机制第五章氨基酸发酵机制谷氨酸，学名：α-氨基戊二酸；其单钠盐：谷氨酸钠，商品称号味精，是重要的调味品。早期消费谷氨酸的方法有两种，一是提取法：甜菜厂付产物糖蜜中含有焦谷氨酸，用强碱处置可得到谷氨酸；二是蛋白质水解法：将面筋加酸水解，再分别提纯。第二篇发酵机制谷氨酸第五章氨基酸发酵机制1957年发酵法消费谷氨酸在日本协和发酵公司投产。日本在谷氨酸发酵消费方面居世界领先位置。味之素、协和等均是其中代表。我国近年的开展也比较快;如河南的莲花味精公司，目前味精产量已从1983年的400吨上升到目前拥有30万吨味精的年消费才干。第二篇发酵机制谷氨酸消费菌可以在体外积累菌体最大生长需求量300多倍的谷氨酸，研讨发现：大量积累是由于：①代谢调理控制；②细胞膜通透性的特异调理；③发酵条件的适宜；第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制一、谷氨酸生物合成途径及调理机制第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制第一节谷氨酸发酵机制第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制〔一〕EMP途径、HMP途径谷氨酸消费菌存在着两种代谢途径：EMP、HMP；EMP/HMP=90/10。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制〔二〕TCA、DCA和CO2固定作用1.TCA环〔三羧酸循环〕第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制P69表5-2：谷氨酸是经过三羧酸循环途径合成的；为此：α-酮戊二酸之前的代谢必需畅通；α-酮戊二酸脱氢酶活性丧失或很小；葡萄糖6-P-葡萄糖3-磷酸甘油醛丙酮酸乙酰CoA磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸草酰乙酸柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸α-酮戊二酸琥珀酸富马酸苹果酸CO2Fe2+CO26-P-葡萄糖酸5-P-核糖①②③④⑤⑥HMP乙酰CoA乙醛酸①②③④⑤⑥CO2谷氨酸NADPH+H+NADPNADP排出细胞DCACO2柠檬酸合成酶顺乌头酸酶异柠檬酸脱氢酶α-酮戊二酸脱氢酶第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制2.DCA环〔乙醛酸循环〕：乙醛酸乙醇乙酸CoA烃类乙酰CoA草酰乙酸柠檬酸乙酰CoA苹果酸富马酸

琥珀酸异柠檬酸β-氧化第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制3.CO2固定苹果酸酶苹果酸脱氢酶CO2草酰乙酸CO2

NAD+

NADH+H+PEPGDPCO2GTPPEP羧化酶丙酮酸苹果酸草酰乙酸+++第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制实验阐明：草酰乙酸靠CO2的固定来补充；已发现的途径有二条：第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制PEP的分解和羧化受细胞能量代谢程度调理；PEP羧化酶的Km较高；〔三〕氨的导入第五章氨基酸发酵机制氨的导入有三种方式：①α-酮戊二酸复原氨基化→谷氨酸②天冬氨酸或丙氨酸经过氨基转移，将氨基转给

α-酮戊二酸③谷氨酸合成酶途径，该酶Km仅谷氨酸脱氢酶的1/10，且不被谷氨酸抑制。第二篇发酵机制氨是氨基酸根本构造之一，氨的导入是氨基酸合成中的根本过程。二、细胞膜通透性控制谷氨酸消费菌的主要生化特点：①α-酮戊二酸脱氢酶活性极低或缺失②谷氨酸脱氢酶活性很高，不被低浓度的谷氨酸抑制③

细胞膜对谷氨酸的通透性高第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制C17酸(佶抗)C18酸C16酸油酸C18(限量)n-石蜡α-KGAα-磷酸甘油脂肪酸生物素磷脂质磷酸二羟丙酮青霉素心磷脂磷脂酰甘油磷脂酰肌醇磷脂酰肌醇二甘露糖酸乙酰CoA3-磷酸甘油醛葡萄糖葡萄糖生物素乙酸细胞膜细胞壁L-GAL-GA柠檬酸聚氧乙二醇十七酸盐第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制三、菌种选育模型与控制方法控制磷脂的合成使细胞膜受损〔如外表活性剂〕青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜经过油酸的合成经过甘油合成直接控制磷脂合成提高细胞膜的谷氨酸通透性控制磷脂含量第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制1.从生物素入手：菌种选育模型及控制方法CH2-CO～SCoA+CO2+ATP(乙酰CoA)生物素Mg2+乙酰CoA羧化酶COOH-CH2CoA+ADP+Pi(丙二酰CoA)生物素是羧化酶的辅酶，促进脂肪酸合成，再合成磷脂。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制选育生物素缺陷型菌株限制外源性生物素供应〔适量～贫乏〕↓磷脂↓↓细胞膜构造不完好↓细胞膜对谷氨酸通透性↑抑制不饱和脂肪酸合成磷脂第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制2.选育油酸缺陷型3.选育甘油缺陷型4.选育温度敏感型突变株由于磷脂构造复杂，又是细胞膜的必要成分，所以磷脂合成妨碍必需是条件型突变，如温度敏感型突变株才干存活，反之，从温度敏感型突变株中可以找到细胞膜合成有缺陷的突变株。5其他，如营养缺陷型；药物抗性突变株；敏感型突变株等第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制微生物的代谢产物可分为：初级代谢产物：微生物经过代谢活动所产生的、本身生长和繁衍所必需的物质。特征：不同的微生物初级代谢产物根本一样；初级代谢产物合成过程是延续不断的，与菌体的生长呈平行关系。第五章氨基酸发酵机制第二节微生物代谢调理及代谢工程第二篇发酵机制次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的化学构造非常复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁衍所必需的物质。特征：不同的微生物次级代谢产物不同；次级代谢产物的通常在菌体的生长后期合成；在多数情况下，添加前体是有效的。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制一、微生物代谢的自我调理第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制微生物细胞的代谢调理方式很多，其中以调理代谢流的方式最为重要，它包括两个方面，一是“粗调〞，即调理酶的合成量；二是“细调〞，即调理现成酶分子的催化活力，两者亲密配合和协调，以到达最正确调理效果。微生物自我调理部位：1营养的吸收和排泄2限制基质与酶的接近3控制通量〔一〕酶活性的调理酶活性的调理：在酶分子程度上，经过改动现成的酶分子活性来调理代谢。包括：抑制；激活；第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制1.酶活性的激活常见的酶活性的激活是前体激活，多发生在分支代谢途径，即代谢途径中的后面的反响可被较前面的一种代谢中间产物所促进。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制2.酶活性的抑制酶活性的抑制包括：竞争性抑制；反响抑制。在代谢调控中，主要是反响抑制。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制反响抑制：反响途径中某些中间产物或末端产物对该途径中前面反响的影响。有正反响和负反响之分。反响抑制的类型直线式代谢途径中的反响抑制第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制分支代谢途径中的反响抑制。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制为防止在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物已开展出多种调理方式。〔1〕同功酶调理同功酶能催化一样的生化反响，但酶蛋白分子构造有差别的一类酶，它们虽同存于一个个体或同一组织中，但在生理、免疫和理化特性上却存在着差别。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制如：大肠杆菌天冬氨族氨基酸合成途径中，有三个同功酶：天冬氨酸激酶ⅠⅡⅢ，分别受赖氨酸、苏氨酸、硫氨酸反响调理。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制〔2〕协同反响抑制：分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才干抑制共同途径中的第一个酶。〔3〕累积反响抑制：催化分支合成途径第一步反响的酶有几种末端产物抑制物，但每一种如过量，按一定百分率单独抑制共同途径中的第一个酶活性，总的抑制效果是累加的，各末端产物所起的抑制造用互不影响，只影响这个酶促反响的速率。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末端产物大得多的反响抑制造用。〔4〕增效反响抑制：代谢途径中任何一种末端产物过量时，仅部分抑制共同途径中的第一个酶活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制造用可超越各产物存在的抑制才干的总和。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制〔5〕顺序反响抑制：每个分支末端产物抑制分支后的第一个酶，产生部分抑制造用。经过逐渐有顺序的方式到达的调理。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制〔二〕酶合成的调理〔酶量〕这是一种在基因表达程度上的调理。分诱导和阻遏调理。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制这种调理方式是较间接而缓慢的调理方式。其优点那么是经过阻止酶的过量合成，有利于节约生物合成的原料和能量。在正常代谢途径中，酶活性调理和酶合成调理两者是同时存在且亲密配合、协调进展的。1.诱导诱导酶：某些酶只需在它们催化的底物〔或底物的构造类似物〕存在时才干合成，此种酶称为诱导酶。诱导酶是细胞为顺应外来底物或其构造类似物而暂时合成的一类酶。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制能促进诱导酶产生的物质称为诱导物，它可以是该酶的底物，也可以是难以代谢的底物类似物或是底物的前体物质。分外源诱导物：外源参与的；内源诱导物：菌体代谢途径的某些中间产物也能诱导该途径的某些酶系的合成，这些中间产物称为内源诱导物。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制酶的诱导合成类型同时诱导:当诱导物参与后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代谢途径中。例如，将乳糖参与到E.coli培育基中后，即可同时诱导出β-半乳糖苷透性酶、β-半乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成；顺序诱导:先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以到达对较复杂代谢途径的分段调理。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制2.阻遏当代谢途径中某末端产物过量时，经过阻遏作用来妨碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制反响阻遏：代谢终产物到达一定浓度时，反响阻遏该代谢途径的一种或几种酶的生物合成。阻遏的类型主要有两种:末端代谢产物阻遏分解代谢产物阻遏。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制〔1〕末端产物阻遏对直线式反响途径，末端产物阻遏的情况较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合成受阻遏。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制对分支代谢途径来说，情况较复杂。每种末端产物仅专注地阻遏合成它的那条分支途径的酶。多价阻遏：有两种或两种以上的末端产物的分支代谢途径中，当分支代谢途径中的几种末端产物同时过量就反响阻遏其分支点以前的共同途径的“公共酶〞的合成，仅一种产物过量无阻遏作用。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制〔2〕分解代谢产物阻遏细胞内同时有两种分解底物〔如碳源〕或其分解产物存在时，被菌体迅速利用的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的景象。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的底物本身直接作用的结果，而是经过其分解过程中所产生的中间代谢物所引起。即：代谢反响链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶的合成。如葡萄糖效应。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制两种调理的对比酶合成的调节酶活性的调节不同点调节对象通过酶量的变化控制代谢速率控制酶活性，不涉及酶量变化调节效果相对缓慢快速、精细调节机制基因水平调节，调节控制酶合成酶分子水平调节，调节酶活性相同点细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准确控制代谢的正常进行。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制〔三〕能荷的调理R曲线合成系统，如磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶等。U曲线耗费ATP的酶系，柠檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶等。当能荷≥0.75，合成遭到抑制，酶活性急速下降，耗费ATP的酶活性急速上升。两系统在0.85处交叉，酶系到达平衡。这种景象存在于许多生长形状的细胞中。细胞经过调理腺苷酸的比例，来协调分解代谢与合成代谢的代谢速率。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制二、代谢调控微生物在正常生长条件下，可以经过自我调理使机体内的代谢途径与代谢类型相互协调与平衡，通常不会过量积累初级代谢产物。在某种条件下，过量积累的中间代谢产物也可以被诱导酶转化为次级代谢产物。但在人为条件的控制下，可以使微生物过量产生各种初级代谢产物和次级代谢产物。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制初级代谢产物控制比较简单。它的构成普通只需求营养条件即可生成。经过改动发酵工艺条件如pH、温度、培育基组成和微生物遗传特性等，到达改动菌体内的代谢平衡，过量产生所需求产物的目的。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制实际中，经过以下途径来实现：发酵条件控制改动细胞的浸透性改动菌种的遗传特性〔一〕发酵条件的控制1.改动发酵条件如：啤酒酵母在中性和酸性条件下培育，可将葡萄糖氧化生成乙醇和二氧化碳；当在培育基中参与亚硫酸氢钠或在碱性条件下培育时，那么并不产生乙醇，而是产生甘油。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制2.运用诱导物如：在木霉发酵消费纤维素酶中，参与槐糖可以诱导纤维素酶的产生；木糖可以诱导半纤维素酶的生成。青霉素酰化酶可用苯乙酸为诱导物。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制3.添加生物合成的前体第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制4.培育基成分和浓度的控制培育基即要保证微生物机体生长需求，又要利于代谢产物的合成，其组成和浓度应防止引起分解代谢阻遏〔采用适当的速效和迟效碳源、氮源及配比〕。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制如，用甘油替代果糖作为碳源培育嗜热脂肪酵母，可以使淀粉酶的产量提高25倍以上；用甘露糖替代乳糖作为培育荧光假单胞菌的碳源，使纤维素酶产量提高1500倍以上。〔二〕改动细胞透性控制影响细胞膜通透性,有利于代谢产物的分泌，可以防止末端产物反响抑制。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制如，利用棒状杆菌的α-酮戊二酸脱氢酶缺失突变株，在葡萄糖培育基中发酵消费谷氨酸，当谷氨酸浓度到达50mg/g(干细胞)时，由于反响调理作用，谷氨酸的合成便终止。〔三〕改动菌种的遗传特性改动微生物的遗传特性，即改动酶的活性或酶的合成系统，使之对反响调理不敏感，到达过量消费代谢产物的目的。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制次级代谢的调理类型次级代谢产物的种类在不同的微生物中不同，所以次级代谢调理类型的多样亦可想而知。知抗生素等次级代谢产物生物合成的调控类型包括诱导调理、碳分解产物调理、氮分解产物调理、磷酸盐调理、反响调理、生长速度调理等。此就共性作一引见：第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制酶合成的诱导调理在次级代谢途径中，某些酶也是诱导酶，在底物或底物的构造类似物存在时才会产生。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制反响调理反响调理在次级代谢产物的生物合成中有着重要的作用，包括:次级代谢产物的本身反响调理；分解代谢产物调理；初级代谢产物的反响调理；第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制分解代谢产物调理再次及代谢途径中，存在与初级代谢类似的分解产物调理景象。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制在许多抗生素发酵中，都发现了葡萄糖的抑制造用。普通是在葡萄糖等速效碳源耗至一定浓度才开场才开场抗生素合成。除了葡萄糖外，凡能促进产生菌生长速度的碳源，对次级代谢产物生物合成都表现出抑制造用。次级代谢产物的合成速率与产生菌的生长速率呈相反关系。初级代谢产物的调理某些初级代谢产物可以调理次级代谢产物的合成，有两种情况：1.初级代谢产物和次级代谢产物的合成有一条共同的合成途径，当初级代谢产物积累时，反响抑制了次级代谢途径某一反响的进展，而最终抑制了次级代谢产物的合成。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制2.初级代谢产物直接参与次级代谢产物的生物合成，即初级代谢产物是次级代谢产物的生物合成的前体，当此种初级代谢产物由于积累，反响抑制了它本身的合成时，必然也同时影响了次级代谢产物的合成。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制磷酸盐的调理在次级代谢产物合成中，高浓度磷酸盐表现出较强的抑制造用，称为磷酸盐调理。磷是微生物生长繁衍的必需元素，浓度为0.3～300mmol/L时，能支持微生物细胞的生长，但当浓度超越10mmol/L时，就能抑制许多抗生素的生物合成。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制ATP的调理作用在研讨四环素的生物合成过程中发现，产生菌体内的ATP程度调理着四环素的合成。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制产生菌生长速率的调理在丰富培育基中进展的分零售酵动力学研讨阐明，大多数发酵过程都分为生长期和消费期。在生长期次级代谢产物合成酶遭到阻抑作用，次级代谢产物不被合成。主要是一些抗生素合成酶遭到抑制或阻遏。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制次级代谢调理：1.酶合成的诱导调理2.反响调理：次级代谢产物本身分解代谢产物的调理初级代谢产物的调理3.磷酸盐的调理：促进初级代谢，抑制次级代谢；4.ATP调理5.产生菌生长速率的调理第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制三、代谢工程代谢工程：利用基因工程技术，定向地对细胞代谢途径进展修饰、改造，以改动微生物的代谢特性，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新的代谢途径，消费新的代谢产物的工程技术领域。第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制第五章氨基酸发酵机制第二篇发酵机制在代谢工程设计中，主要有改动代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种。改动代谢途径改动代谢途径是指改动分支代谢途径的流向，阻断其他代谢产物的合成，以到达提高目的产物的目的。改动代谢途径有各种方法，如加速限速反响、改动分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改动能量代谢途径等不同方法。第五章氨基酸发酵机制第二篇