结构生物学等

构造生物学的研讨方法和技术生物大分子要发扬功能，必需满足两个条件:第一，凡要发扬功能和活性的生物大分子必需具有特定的，本身特有，相对稳定的三级构造;第二，构造运动。任何的破坏促使没有稳定的三级构造和构造运动，生物大分子是很难发扬生物功能或活性的。构造生物学概念及主要研讨方法构造生物学是经过确定生物大分子三级构造，来研讨生物大分子的构造功能关系，从而讨论生物大分子的作用机制和原理作为研讨目的。主要研讨方法:X-射线晶体衍射方法〔X-射线蛋白质晶体学〕多维核磁共振〔NMR〕电镜晶体学和电镜三维重组方法构造生物学的开展60年代当时的开文迪许实验室的M.PerutzJ.Kendrew用X-射线晶体衍射技术获得了球蛋白的构造.由于X射线晶体衍射技术的运用，使我们可以在晶体程度研讨大分子的构造，在分子原子根底上解释了大分子.由于他们开创性的任务，Waston,Crick获得了1962年的诺贝尔生理学与医学奖,M.Perutz和J.Kendrew获得了同年的化学奖.从那时起，技术的开展就成为构造生物学开展最重要的决议要素。来源：1950s,Waston,Crick发现了DNA双螺旋构造，建立DNA的双螺旋模型。60-70年代,在同一实验室的他们又开展了电子晶体学技术，当时的研讨对象主要是有序的,对称性高的生物体系，如二维的晶体和对称性很高的三维晶体。70-80年代，多维核磁共振波谱学的发明使得在水溶液中研讨生物大分子成为能够,水溶液中的生物大分子更接近于生理形状.80年代到本世纪初,冷冻电子显微镜的发明,这种技术的发明使我们不仅可以研讨生物大分子在晶体形状和溶液形状的构造，而且可以研讨研讨复杂的大分子体系超分子体系，这就是细胞器和细胞.可见构造生物学的开展过程阅历了从结晶到溶液再到大分子体系,超分子体系,如核糖体(ribosome),病毒,溶酶体(lysosome),线粒体等.

X-射线晶体衍射方法X射线单晶衍射技术是由H.W.布拉格和W.L.布拉格父子于1912年提出和开展起来的.此技术最先用于无机晶体分析,后来到1953年,沃森和克里克用于DNA晶体分析,至60年代,肯德鲁和佩鲁兹用于研讨血红蛋白和肌红蛋白,逐渐成为生物大分子晶体构造研讨的重要手段,直至今天仍占据统治位置。优点是分辨率高,到达原子分辨率,既可研讨水溶性蛋白、也可研讨膜蛋白和大分子组装体与复合体。它能给出生物大分子的分子构造和构型,确定活性中心的位置和构造,从分子程度了解蛋白质如何识别和结合客体分子,如何催化,如何折叠和进化等生命的根本过程,进而阐明生命景象。如1997年底,运用X射线单晶衍射方法完成了有关核小体(nucleosome)的中心颗粒分辨率为0128nm的精细空间构造的测定,每个核小体的盘状中心含有8个组蛋白构成的八面体、外绕146个碱基对组成的DNA,这一出色的成就对了解基因转录、DNA复制与修复的动态过程都很重要.此外,运用X射线单晶衍射技术测定蛋白质和核酸的晶体构造并结合分子模拟技术,曾经为新药物的设计提供了一个全新的方向,大大缩短了新药的研制过程.新药的设计和开发,要求对这些药物靶标(drugtarget)的构造、性能有准确的了解,由于迄今对其了解甚少,现有临床药物绝大多数是经过尝试挑选获得的,导致研制一个新药经常需十多年,甚至几十年的时间.经过对爱滋病病毒(HIV)蛋白酶的精细构造测定,并以此为靶标设计酶的抑制剂作为治疗爱滋病的有效药物获得宏大胜利,已显著减少爱滋病死亡数量.X-ray测定生物大分子构造的原理为什么要用X-射线d假设原子的尺度为dl>>dl≤d只需光源波长与妨碍物尺度相当，或者光源波长小于妨碍物尺度的时候才干探测到妨碍物的信息。X-射线的波长与原子以及化学键的尺度相当，都在Å的数量级。因此可以被用来探测蛋白质分子内部的构造。X-rayProteinCrystal为什么要用衍射把光源换成X射线把透镜换成X射线透镜到目前为止人类还没有发现什么方法可以让X-射线发生折射。所以当前只能经过衍射这种不那么直观的方法来研讨蛋白质分子内部构造。什么是晶体晶体在宏观上呈现出规那么的几何外形NaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaCl二维陈列三维堆积晶体是一种具有长程、三维分子有序的固体。小孔光栅衍射图样如何根据衍射结果解析蛋白质构造参考f(x)=Acos(2px–a)上式也可表示为：r为电子密度，xyz为实空间坐标V为晶胞体积|F(hkl)|2=I(hkl)，I代表衍射点的强度，hkl为衍射点坐标a代表初始相角hkf(x)=Acos(2px–a)a=0x12340a=p/2x12340a=-px1234000对于一束X-射线f(x)=Acos(2px–a)来说，无论它的初始相角是多少，它在接纳屏上所构成的曝光点都是一样的。反之，我们只根据接纳屏上的曝光点也是无法得知呵斥该曝光点的X-射线的初始相角信息的。初始相角无法直接丈量得到，但它又是求解电子密度时所必需的信息。这就是X-射线晶体衍射法解析物质构造时所需求处理的中心问题——相位〔相角〕问题。处理相位问题的方法：同晶置换法最原始的方法，包括多对同晶置换法和单对同晶置换法。需求在蛋白质晶体中引入重原子，并且要求引入了重原子的晶体与未引入重原子的晶体的晶型根本一样。解析过程需求未引入重原子、引入了重原子，甚至引入了不同重原子的多颗晶体的多套衍射数据。反常散射法包括多波长反常散射法和单波长反常散射法。通常需求引入具有较强反常散射才干的原子，如硒原子。不需求多颗晶体但往往需求同一颗晶体在不同波长X-射线照射下的多套衍射数据。随着技术的提高，目前蛋白质本身的硫原子也开场被用来作为反常散射源。分子置换法需求同源性较高的蛋白质分子构造模型，不需求多颗晶体，不需求多套衍射数据，方便快捷，但不能用来解析全新的构造。主要技术流程图蛋白质结晶的必要条件蛋白质分子必需均一〔纯化〕均一的蛋白质分子不均一〔不纯〕的蛋白质分子沉淀剂的作用沉淀未饱和成核区过饱和区蛋白质浓度沉淀剂浓度获得蛋白质晶体的方法由于蛋白质分子体积大，分子外表情况复杂，极性不明显，分子间作用力弱等缘由，蛋白质分子在到达过饱和的时候不容易有序陈列构成晶体，而是容易随机聚合构成沉淀。因此需求针对不同蛋白质挑选各自的结晶条件。蛋白质结晶技术：整批结晶法液液分散法透析法气相分散法a.悬滴法b.座滴法悬滴法1ml蛋白溶液1ml结晶溶液结晶溶液池座滴法1ml蛋白溶液1ml结晶溶液结晶溶液池无论是悬滴法还是座滴法，当到达蒸汽平衡的时候，蛋白质所在液滴里的结晶溶液组分的浓度将会接近于池液的浓度。结晶溶液结晶溶液成分：沉淀剂通常为不同分子量的聚乙二醇或者高浓度的硫酸铵、氯化钠等。辅助分子通常为低浓度的盐pH缓冲剂例如：HamptonResearchCrystalScreenKit#140.2MCaCl20.1MHEPESpH7.528%(v/v)PEG400Detergentsandadditives结晶条件的优化最初挑选得到的结晶条件往往不是该蛋白的最正确结晶条件。此时的蛋白质晶体往往衍射才干很差，甚至没有衍射。因此普通来说还需求对该蛋白质的结晶条件进展优化。优化的方法就是把结晶溶液中的沉淀剂、辅助分子，结晶时的蛋白质浓度在原浓度附近做一个梯度；相应地，结晶溶液中的pH值也要在原值附近做一个梯度。在把这些梯度陈列组合起来，从而找出一个最正确的结晶条件。优化前优化后衍射实例缺陷：样品必需为晶体〔单晶〕,但生物大分子结晶困难,特别是膜蛋白和病毒等分子组装体结晶更是困难.其次对于像病毒那样大的分子组装体,丈量其精细构造非常复杂.缘由有二:一是大晶胞含有的原子极多,X射线衍射点极多,经常无法区分、识别和探测;其二是大晶胞所产生的衍射点强度过弱,特别在高分辨时,无法与背景区分.NMR也是测定生物大分子构造重要手段根本原理：核磁共振景象(nuclearmagneticresonancespectroscopy,NMR)1946年由哈佛大学的伯塞(E.M.Purcell)和斯坦福大学的布洛赫(F.Bloch)所指点的2个小组,用不同的方法在各自的实验室里察看到的,伯塞尔运用的实验方法是吸收法,而布洛赫运用的是感应法.利用物理原理,经过对核磁共振谱线特征参数的测定来分析物质的分子构造与性质。NMR不破坏被测样品的内部构造，是一种无损检测方法。由于不同的原子核吸收不同的电磁波，因此经过测定和分析受测物质对电磁波的吸收情况就可以断定它含有哪种原子，原子之间的间隔有多大，并据此分析出它的三维构造。以蛋白质为例,它的二级构造如α螺旋,β折叠、转角、环形和卷曲等,表达了蛋白质分子主链原子在三维空间各种不同的陈列规律性.位于不同二级构造域的原子核间距,原子核间的相互作用以及多肽段的动态特性,都直接反映蛋白质三维构造的特征.这些具有不同构造特征的原子核间距、肽键二面角、肽键的动态特性等都具有特征的核磁共振谱线.因此,我们分析核磁共振谱就可以获得蛋白质的三维构造.1H,13C,15N是核磁共振检测的主要对象,各有不同的共振频率,从而构成核磁共振氢谱、碳谱和氮谱三部分.核磁共振

(NuclearMagneticResonance-NMR)在水溶液中,大约有一半的蛋白质链呈现出规那么、严密的三维构造,而另一半那么非常松。目前,科学家曾经利用这一方法绘制出15%～20%的知蛋白质的构造。最初,核磁共振技术主要用于核物理研讨方面,用它丈量各种原子核的磁矩,误差仅是0.003%～0.005%;迄今,它已广泛运用于化学、食品、医学、生物学、遗传学等学科领域,已成为在这些领域开展研讨任务的有力工具,甚至是某些领域(如:化学、医学诊断、药物学等)常规分析中不可短少的手段。1985年,维特里希(KurtWüthrich〕等人公布了第一次利用NMR法测定的溶液中蛋白质-蛋白酶抑制剂IIA(proteinaseinhibitorIIA)的构造(如图4所示)。1990年用NMR测定的蛋白质构造有23个,而到1994年一年测定的蛋白质构造数上升到100个。1997年,维特里希运用NMR方法测定的一种蛋白质-蛋白感染素(prionprotein)的构造。核磁共振方法的最大特点是可以直接在溶液中测定自然形状下的大分子三维空间构造，其分辨率已接近012nm,但由于大分子量的生物分子的核磁共振图谱非常复杂,难以解释,因此它只能丈量分子量较小(15-25kDa)的生物分子,至今最大可测定35kDa的生物分子;其次在测定中要求样品是高纯度且数量相对较多,使样品制备亦有困难;此外,核磁共振只能用于水溶液性的生物样品,对膜蛋白或病毒等的组装体、复合体就无法测定.另一种方法称为冷冻电镜计算机三维重构方法或单颗粒技术〔Cryo-EM〕.特点:急速冷冻(103-104℃Ps)样品悬液,样品被包埋在无定形的非晶态冰薄膜中,这样既不损伤样品,又可使样品坚持着自然形状,因此样品制备简单。缺陷：分辨率稍低.研讨的病毒样品,目前分辨率接近0.17nm,估计这几年内可达0.14nm.核糖体可达1.10nm,而离子通道可达2.10nm.由于运用冷冻电镜与计算机重构技术研讨病毒三维构造所需样品制备简单,对病毒的大小没有限制,使其开展很快,至今已有100多个病毒的三维构造被冷冻电镜计算机重构方法所阐明,远远超越X射线晶体学的30-40种病毒的数量.虽然其分辨率还有待提高,但所提供的资料和数据对于生命科学的许多研讨来说,曾经是非常珍贵和重要的根据,甚至曾经满足了某些研讨的要求.假设把这种研讨方法与用X射线单晶衍射所获得的病毒衣壳高分辨三维构造结合起来那就更有意义了.冷冻电镜计算机重构方法虽然其开展历史较晚,但特别有利于病毒、核糖体、离子通道等大的复合体、组装体等的构造与功能的研讨,是构造生物学的新开展方向.这些研讨既是构造生物学的重要内容,又是正在走向综合的重要一步.Cryo-EMstructureofprokaryotic30STranslationInitiationComplex3.6-AngstromcryoEMstructureofhumanadenovirustyp