芳香新塔花总黄酮保护内皮细胞、抑制炎症反应的抗动脉粥样硬化作用及机制研究

芳香新塔花总黄酮保护内皮细胞、抑制炎症反应的抗动脉粥样硬化作用及机制研究目的:动脉粥样硬化（AS）是心血管疾病的病理基础,严重影响人类的健康。课题组前期研究天香丹治疗心血管疾病疗效确切,而芳香新塔花（Ziziphoraclinopodioid-esLam.）是天香丹的主药,是新疆的地产药材,长期用于治疗心血管疾病。研究证实芳香新塔花具有降压、保护心血管和抗动脉粥样硬化的功效,主要活性成分为黄酮类化合物,但其抗AS的物质基础和作用机制不明确。血管内皮细胞损伤和炎症是动脉粥样硬化的重要发病机制,参与AS的发生和发展。因此保护血管内皮细胞和抑制炎症是防治动脉粥样硬化的重要靶点。本实验对芳香新塔花总黄酮（TotalflavonoidsfromZiziphoraclinopodioidesLam,TFZC）进行制备工艺优化和成分分析,建立内皮细胞损伤和脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）炎症模型,探讨其抗动脉粥样硬化的物质基础和作用机制,为其临床应用提供实验依据。方法:（1）利用单因素实验考察各个提取因素（乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度）对芳香新塔花总黄酮含量的影响,并利用正交实验优化方案,确定超声波辅助提取工艺。以芳香新塔花总黄酮吸附率和解析率为考察指标,对4种不同型号的大孔吸附树脂（AB-8、D101、HPD-100、HP-20）进行筛选,确定适宜芳香新塔花总黄酮纯化的树脂。通过考察各个因素（上样液浓度、pH值、径高比、上样液流速、洗脱剂浓度、洗脱流速、洗脱体积）,确定最佳纯化工艺。利用超高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS/MS）,在电喷雾离子源（ESI）正负离子模式下分析芳香新塔花总黄酮的化学成分。（2）采用H₂O₂诱导HUVECs建立内皮细胞氧化损伤细胞模型,给予药物干预,分为正常组、模型组、芳香新塔花总黄酮低、中、高剂量组,阳性药维生素C组。用CCK-8法测定各组细胞存活率的变化,确定最佳作用浓度和时间。用试剂盒测定各组细胞上清液中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）和还原性谷胱甘肽（GSH）含量。用Hoechst33342荧光染色和AnnexinV-FITC/7-AAD双染流式细胞仪检测细胞凋亡;用流式细胞仪检测各组线粒体膜电位和活性氧（ROS）的变化。用激光共聚焦观察经过Cyto-ID?Green染色的自噬体的变化。用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测细胞内Bcl-2、Bax、cleavedCaspase-3、LC-3和Beclin-1蛋白的表达情况。（3）采用LPS诱导RAW264.7建立炎症细胞模型,给予药物干预,分为正常对照组,模型組,阳性药阿托伐他汀钙组,芳香新塔花总黄酮低、中、高剂量组,TAK-42（TLR4特异性阻断剂）组。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）检测芳香新塔花总黄酮对RAW.264.7细胞活力的影响,Griess法测定细胞上清中一氧化氮（NO）,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot法测定TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κBp65mRNA和蛋白表达情况。结果:（1）超声波辅助提取芳香新塔花总黄酮工艺优化,确认了最佳提取工艺为:乙醇体积分数70%,料液比1∶50,提取时间50min,提取温度60℃,提取2次。（2）筛选HP-20型大孔吸附树脂纯化芳香新塔花总黄酮,确认了最佳纯化工艺为:上样液量为3mg/ml,pH为3,径高比为1∶10,上样液流速为3BV/h,最大上样量为7BV,先用水洗脱,随后用5BV、50%乙醇洗脱,洗脱流速为3BV/h。最终芳香新塔花总黄酮纯度达63.1%。（3）利用超高效液相-质谱技术共鉴定或推测出18个化合物,其中黄酮类化合物16个,分别为黄芩素（1）、山柰酚3-O-β-D-吡喃半乳糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷（2）、槲皮素（4）、山柰酚3,7-O-α-L-二鼠李糖苷（5）、金丝桃苷（6）、芦丁（7）、山柰酚-7-O-新橘皮糖苷（8）、QuadranosideIII（9）、山柰酚-3-O-β-D-吡喃半乳糖基（1→6）-α-L-鼠李糖苷（10）、芹菜素-7-O-新橘皮糖苷（11）、地奥司明（12）、白杨素-7-O-新橘皮糖苷（13）、5,7-二羟基二氢黄酮-7-O-β-D-吡喃半乳糖基（1→6）-α-L-鼠李糖苷（14）、蒙花苷（15）、山柰酚（16）、白杨素（17）。香豆素类化合物1个:东莨菪素（3）。倍半萜类化合物1个:对映-16β,17-二羟基贝壳杉烷-19-羧酸（18）。其中化合物2、3、5、8-11、13、14、18未见报道。（4）800μmol/LH₂O₂干预HUVECs4h,细胞变圆形、细胞膜边缘模糊不清楚。CCK-8法检测细胞存活率54.38±3.61%,建立H₂O₂诱导HUVECs模型。（5）芳香新塔花总黄酮在1¹00μg/ml范围内对HUVECs存活率无明显影响。芳香新塔花总黄酮低、中、高剂量组和维生素C组可提高H₂O₂诱导HUVECs细胞的存活率、SOD活性和GSH含量,降低MDA和LDH含量（P<0.05或P<0.01）。（6）芳香新塔花总黄酮低、中、高剂量组和维生素C组可不同程度减轻H₂O₂诱导HUVECs凋亡,与正常组相比,模型组凋亡率明显升高（29.30±4.59%Vs2.90±0.07%）,（P<0.01）;与模型组相比,芳香新塔花总黄酮低、中、高剂量组和维生素C组凋亡细胞比例显著下降（分别是18.20±1.87%,12.85±1.28%,9.87±0.63%,14.13±1.63%）（P<0.01）。（7）流式细胞仪检测线粒体膜电位和ROS,线粒体膜电位结果示模型组线粒体膜电位显著降低,而芳香新塔花总黄酮低、中、高剂量组和维生素C组线粒体膜电位显著升高。模型组细胞内ROS水平升高,而芳香新塔花总黄酮组和维生素C组细胞内ROS水平下降（P<0.01）。（8）经过Cyto-ID?Green染色后,激光共聚焦观察正常对照组、模型组和维生素C组绿色点状荧光较少,而芳香新塔花总黄酮组绿色点状荧光增多,随着剂量的增加,绿色荧光物质逐渐增多。（9）芳香新塔花总黄酮和维生素C可显著抑制H₂O₂诱导HUVECs细胞Bax和cleavedCaspase-3蛋白表达的上调及Bcl-2表达的下调,并能上调LC3-Ⅱ和Bec1in-1蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）。（10）LPS1μg/ml刺激RAW264.7细胞24h,可成功构建炎症细胞模型。（11）芳香新塔花总黄酮在1¹00μg/ml浓度范围内对RAW264.7细胞的活力无影响。（12）芳香新塔花总黄酮低、中、高剂量组和阿托伐他汀组能够显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞NO的释放（P<0.01）,抑制率分别为19.12%、28.71%、32.05%和30.21%。而TAK-242可减弱TFZC抑制作用,抑制率为9.52%。芳香新塔花总黄酮低、中、高剂量组和阿托伐他汀组可下调LPS诱导RAW.264.7细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌（P<0.05或P<0.01）,TAK-242能部分抵消TFZC下调TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的作用。（14）芳香新塔花总黄酮中、高剂量组和阿托伐他汀组可显著降低RAW.264.7细胞TLR4、MyD88、TRAF-6和NF-κBp65mRNA和蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）。芳香新塔花总黄酮低剂量组降低MyD88和NF-κBp65mRNA和蛋白的作用不显著（P>0.05）,其中阿托伐他汀效果最为明显;TAK-242能部分抵消TFZC降低TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κBp65mRNA和蛋白的作用。结论:（1）超声提取和HP-20纯化芳香新塔花总黄酮工艺稳定,超高效液相质谱联用技术初步分析其化学成分,为抗