微生物快速检测 1节 食品微生物 计数 1

1第二章食品致病微生物

快速检测方法浙江工商大学食品与生物工程学院赵广英2内源性：致病微生物（非健康/健康）非致病菌条件致病菌外源性：环境体表在此，只介绍影响食品安全之微生物的定量和定性的快速检测腊样芽孢杆菌食品中微生物的主要来源？3第一节微生物数量的快速检测第二节致病微生物种类的快速检测4第一节

食品微生物数量的快速检测1浙江工商大学食品与生物工程学院赵广英5学时数：1节1：1学时＋1节2：1学时

n教学目的：了解和掌握三大类（活菌细胞计数方法、用于估计微生物数量的新方法和其他方法各种）细菌等微生物计数方法中的各种计数方法。n重点：上课时强调重点的快速计数方法。n难点：真正系统掌握并记住上述重点知识并应用。

6第一节微生物数量的快速检测1

检测食品中微生物的数量可成为评价食品质量和卫生状况的科学依据。

常规检测：“菌落总数测定”

“霉菌和酵母数的测定”

“大肠菌群测定”

“大肠杆菌检测

“粪大肠菌群检测”

“金黄色葡萄球菌检测”

都是指的活细胞计数常用培养来检测，故慢而繁琐。现代（改进的或新的）方法：可以快速、简便，甚至现场检测。评价食品品质评价食品卫生状况一、活菌细胞计数的改进方法二、用于估计微生物数量的新方法

三、其他方法8一、活细胞计数的快速检测方法

1．旋转平皿计数方法2．疏水性栅格滤膜法(HGMF)

或等格法(ISO-GRIDmethod)

3．皿膜系统(Pertrifilm)4．专有酶底物技术(ColiComplete)5．直接外荧光滤过技术(DEFT)

6．“即用胶”系统(SimPlate)9旋转(螺旋)平皿计数方法(spiralplantingmethod)：

用螺旋平板注入器，把液态样品螺旋式并不断稀释地接种到一个旋转的平皿中，36℃土1℃培养48h+3h后，观测计数。

1．旋转(螺旋)平皿计数方法10螺旋平板原理平皿旋转接种针往外移动同时自动将样品稀释1000倍11Rapidcolonyenumerationwith"SpiralSystem®"SprialPlater+旋转接种仪视频网址：

12螺旋平板法DWS螺旋平板接种仪aColyte自动菌落计数仪13螺旋平板法的优缺点优点：与传统方法相比，无需稀释3个梯度，每个梯度倒2个平板，节省了大量人力物力。缺点：检测时间并没有缩短，菌落总数仍需要培养48h。需要配合自动菌落计数仪，否则人工计数更麻烦。仪器比较贵疏水性栅格滤膜法(HGMF)/薄膜计数法/等格法(ISO-GRIDmethod)

（1）原理：用疏水性栅格滤膜(HGMF)过滤样品，放置在相应的固体培养基中培养，观察细菌、酵母菌或霉菌菌落。疏水性的栅格作为栅栏以防止菌落的扩散保证了所有菌落都是正方形的，从而便于人工或机械计数。

滤膜法常用于可过滤样品的微生物检测2．疏水性栅格滤膜法(HGMF)/薄膜计数法

/等格法15（2）仪器设备:HGMF过滤装置

（3）步骤：

①样品稀释

②粗滤：通过5

m的不锈钢预过滤器过滤，过滤掉可能引起微生物分析误差的样品残渣颗粒。

③细滤：通过0.45

m的疏水性滤膜过滤（含1600个小方格）

0.22

m更好！

④培养：将滤膜放在特定的琼脂培养板上培养

⑤鉴别和记数16（4）优缺点：优点：灵敏度增大，菌落无扩散情况，便于计数快速、简便、重复性好。缺点：需要额外的支出购买真空泵，多联支架及一次性滤膜；如果抽滤过程空气洁净度不够，有可能造成二次污染，尤其是对菌数要求特别严格的产品，如啤酒，澄清果汁，桶装饮用水等。17

（5）适用范围：依培养基不同适于沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、酵母、霉菌、大肠菌群及大肠杆菌的计数和检测。

（6）经AOAC*认可的此类方法主要有：AOAC公定方法986．32《食品中的需氧平板计数疏水性栅格滤膜法》；AOAC公定方法983．25《食品中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌疏水性栅格滤膜法》AOAC公定方法995．21《食品中的酵母和霉菌计数-疏水性栅格滤膜法(1SO-GRID)使用YM-11琼脂方法》。

*AOAC：(AssociationofOfficialAnalyticalChemists)即美国分析化学家协会，国际公职分析化学家协会薄膜计数法薄膜——微孔滤膜（φ0.45um）（2）滤膜培养膜有菌面冲上原理——膜抽滤（细菌浓缩）+膜平板培养

+

计数（1）抽滤（滤器及膜事先灭菌）（3）统计计数提问：假如测出250个菌落，抽滤了50ml自来水，自来水中菌浓度是多少呢？

250÷50ml=5个/ml自来水样品中的细菌数量=菌落数÷抽滤样品的体积数要求——样品洁净如空气或饮用水。？堵孔、菌太多难以分散提问：如何用活菌计数法测定较脏的水样？减少滤液体积、无菌水稀释203．皿膜系统(Pertrifilm)皿膜系统，如Pertrifilm3MSystem，可用于菌落总数、大肠菌群、大肠埃希氏菌、霉菌、酵母和金黄色葡萄球菌计数。可计数、定性和定量

21(1)原理

如下图所示，在一双层膜系统内含有干燥的营养物质(类似平板计数琼脂或其他的选择性培养基成分)和冷水可溶的胶体物质，以每系统lmL的加样量将样品(稀释或未经稀释的样品)直接加到基础膜中间，盖上含有胶凝剂和TTC的覆盖膜，培养后细菌在双层膜之间生长并显色即可直接计数。22薄膜粘合剂＋指示剂冷水可溶性凝胶印有格子纸片标准选择性培养基粘合剂3MPetrifilm的结构23

(2)皿膜系统

(Pertrifilm)的

种类：242526（3）步骤：

27自动判读仪28（4）代表方法：

AOAC986.33《牛奶中的细菌和大肠菌群计数》；AOAC989.10《乳品中的细菌和大肠菌群计数》；AOAC990.12《食品中需氧平板计数》；AOAC991.14《食品中大肠菌群和大肠艾希氏菌计数》AOAC996.02《乳制品中的大肠菌群计数》；AOAC997.02《食品中酵母和霉菌计数(Pertrifilm’”方法)》

GB第三法大肠杆菌PetrifilmTM测试片计数法

GBT4789.38-2008注意判读

1.大肠杆菌PetrifilmTM

测试片上蓝色有气泡的菌落确认为大肠杆菌，不论蓝色的深浅，部分蓝色的带气泡菌落也判定为大肠杆菌。

2.圆形培养膜边缘及边缘以外的菌落不计数。3.当测试片出现大量气泡、不明显的小菌落，培养区呈蓝色时，需要进一步稀释样品匀液，重新检验。1.测试片上的菌落数都小于15，计数最低稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数2.如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，以“小于1乘以最低稀释倍数”报告3.如果所有稀释度的菌落数都大于150，计数最高稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告稀释文本文本选择菌落数在15～150之间的稀释度，两张测试片菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以CFU/g(CFU/mL）表示。计数规则大肠杆菌测试片计数的报告

32附：餐饮具卫生测定－“纸片法”纸片法是目前被广泛接受的方法。国标餐具大肠菌群采用的就是纸片法。优点：无需制备培养基，携带方便，非漫延菌落计数较方便。缺点：不能节省检测时间。检测成本相对偏高。大肠菌群纸片存在与MPN法无法对应的问题，金黄色葡萄球菌纸片存在取样量太低的问题。目前仅细菌总数纸片有一些用户。餐饮具大肠菌群检测纸片使用说明摘自国家GB14934-94餐（饮）具消毒卫生标准

、采样方法

随机抽取消毒后准备使用的各类食具(碗、盘、杯等)，取样量可根据大、中、小不同饮食行业每次采样6～10件，每件贴纸片两张，每张纸片面积25cm2(5cm×5cm)用毛细吸管吸取无菌生理盐水湿润大肠菌群检测用纸片后，立即贴于食具内侧表面，30秒后取下，置于无菌塑料袋内。筷子以5只为一件样品，用无菌生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端约5cm)抹试纸片，每件样品抹拭两张，放入无菌塑料袋内。2）检验方法将已采样的纸片置37℃恒温培养箱中培养16～18h，若纸片保持紫蓝色不变或有红色斑点但斑点周围无黄晕为大肠菌群阴性，在红色斑点周围有黄晕或纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性。3

）

卫生指标

在2×25cm2的纸片上（即两片纸片上），不得有大肠菌群阳性结果出现。如图：阳性结果（满视野）餐饮具卫生（大肠菌群）现场采样检测箱使用说明

操作方法：将100%酒精倒入酒精灯中，用酒精灯将镊子和剪刀头部消毒。2.用酒精棉球将手消毒。3.用酒精棉球将表面皿（培养皿）擦拭消毒，待酒精挥干后，倒入适量专用生理盐水。4.剪开检测纸片外包装，用镊子取出纸片，沾取专用生理盐水后，立即贴于食具内侧表面，30秒后取下，置于原塑料袋内。5.将装有纸片的塑料袋置于37℃恒温培养箱中培养16～18h观察结果。配置：检测纸片50份,专用生理盐水2袋,镊子2把,剪刀1把，酒精灯1个，75%酒精棉球1瓶，100%酒精1瓶、培养皿5个，餐饮具卫生（大肠菌群）检测纸片专用恒温培养箱1台，光盘和说明书各1份。适用范围：

餐饮具大肠菌群检测纸片专用恒温培养箱，适合于餐饮具大肠菌群检测纸片培养使用，具有便携、易操作等特点。仪器参数：额定电压220V，额定频率50HZ,额定功率25W，恒温37～40℃，容量2L操作方法：1.将培养舱放在台面上，两只手掌压住舱盖，双手手指（拇指除外）向上翻动舱盖边缘即可轻易打开舱盖。2.将装有检测纸片的塑料袋放入培养舱内，盖好舱盖，将培养舱放入培养箱中，盖好箱盖。3.接通电源，并按电源开关，液晶屏上显示0：004.设定培养时间17小时，5.按启动开关，屏幕显示太阳图标，培养开始倒计时，

17小时后培养结束（雪花图标出现）。6.打开舱盖，取出纸片观察结果。38

用途：计数食品中的大肠菌群大肠埃希氏菌

原理：

1)存在于食品样品中的大肠菌群特有的酶系统5-溴-4-氯-3吲哚-

-D吡喃半乳糖苷（放到培养基中）“

－D－半乳糖苷酶系统”5-溴-4-氯-3-吲哚氧化水不溶性蓝色的二聚物

判定结果4．专有酶底物技术(ColiComplete)392）大肠埃希氏菌、志贺氏菌和一些沙门氏菌特有

4－甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷

“

—葡萄糖苷酶”4－甲基伞形酮波长UV光下(366nm)紫外光产生荧光

判定食品中是否有大肠菌群和大肠埃希氏菌40吖啶橙（acridineoringe,AO）染色计数法在国外已逐步作为细菌计数的一种标准方法，应用于水、食品等领域。原理：AO能快速与脂质结合，并能通过脂质双层膜，进入活细胞，在胞浆内主要富集与溶酶体/以插入的方式和双螺旋的DNA分子结合－激发后使活细胞显黄绿色荧光。Baumgart用直接表面荧光滤膜技术快速检验肉末中的微生物，结果与标准平皿计数法检验结果的相关系数为0.97。

3）染料活菌计数法

（1）吖啶橙染色计数法国外应用：41（2）吖啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）染色法吖啶橙染色后，使活细胞呈黄绿色荧光，而非活细胞

则成红色或橙红色；。

文字：

活细胞－－黄绿色荧光死细胞－－橙红色荧光溴化乙锭仅能透过受损细胞膜，嵌入DNA，发橘红色荧光（3）四哩盐染色法（1）染料：四哩盐是一种能接受氢原子的染料,化学名为3-（4,5-H甲基唆哩-2）-2,5-H苯基四氮哇澳盐,商品名为鹰唆蓝,简称My。原理：活细胞线粒体中的琉琅酸脱氢酶能使外源性的MIT的四哩环还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲胞（Faan,而死细胞无此作用。用二甲基亚枫（DMSO）溶解此蓝紫色结晶物,该溶液在一定波长下的光吸收值可间接反映活细胞数量。在一定细胞浓度范围内,光吸收值与活细胞数成正比。本法具有工作量小、操作简便、快速、重复性好等优点,该方法已广泛应用于动物细胞的活细胞计数、生物因子的活性检测、抗肿瘤药物的大规模筛选、细胞毒性试验等（魏鸿刚,李元广,刘健微生物学通报）43（4）台盼蓝染法台盼蓝染法鉴别死活细胞的原理:死细胞的细胞膜无屏障作用，台盼蓝马上进入细胞而显蓝色。活细胞细胞膜有选择透性，对台盼蓝的透性小，进入细胞慢。经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。酵母大细胞比较适用。若染色时间过长，台盼蓝可能通过胞吞或胞饮作用进入活细胞不好区分死活细胞。第二法大肠杆菌VRB—MUG平板计数法第二法不适用于贝类产品

GBT4789.38-2008VRB—MUG琼脂:结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷琼脂据反映该方法不是很好用，目的菌很少时尚可，多时难以计数分解的4-甲基伞形酮扩散后难以计数检验1.选取2个～3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别取1mL注人两个无菌平皿。另取1mL稀释液注人一个无菌平皿中，作空白对照。2.将45℃±0.5℃的VRB琼脂10mL～15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。3.待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRB-MUG琼脂覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36℃±1℃培养18h～24h。4.选择菌落数为10～100的平板，暗室中360nm～366nm波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。结晶紫中性红胆盐（violetredbile,VRB