微生物快速检测 2节4 指纹图谱技术

第七类：指纹图谱法

用于微生物的鉴定与分型食品与生物工程学院

赵广英2016年10月06日目录1.定义2.分类及原理3.指纹图谱的分离及检测技术4.指纹图谱的分析1.定义微生物指纹图谱是指微生物体某些复杂物质，如蛋白质或细胞的DNA等，经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图

.2.1DNA

指纹图谱

2.1.1随机扩增

DNA片段多样性2.1.2限制酶切的

DNA片段长度多样性2.1.3PCR—RT2.1.4REP-PcRREP-PCR2.1.5AFLP2.1.6质粒指纹图谱

2.1.7基因组测序和16SrDNA测序2.分类及原理2.2RNA

指纹图谱2.3蛋白质指纹图谱2.4其他生物大分子指纹图谱2.4.1脂肪酸指纹图谱2.4.2生物大分子红外光谱2.4.3生物质谱

(Bio—MS)分析法2.1DNA

指纹图谱

2.1.1随机扩增

DNA片段多样性:RAPD(RandomlyAmplifiedDNAPolymorphism)，用随机引物进行扩增，因此也称为

ArbitraryPrimedPCR，AP—PCR。特点：对目标序列完全未知的情况下进行开创性的研究，特别是在被研究对象无法进行人工培养，而又难以分离提纯

(如植原体)时。RAPD的缺点在于其获得的

DNA指纹图谱不稳定，图谱受

PCR反应条件、DNA纯度和浓度等诸多因素的影响，不同实验室之间的实验结果常常难以比较。采用商品化的

AP—PCR试剂盒和标准化的引物，有利于得到相对标准化的结果，但仍未从本质上解决问题。2.分类RAPD的分辨力取决于所选用的引物。而选择理想的AP—PCR引物具有很大的偶然性。2.1.2限制酶切的

DNA片段长度多样性：RFLP(RestrictedFragmentsLengthPolymorphism)定义与原理：用限制性内切酶将整个基因组DNA酶切，酶切片段经电泳分离即可获得整个基因组DNA指纹图谱，依其多样性进行鉴定的技术。优点：具有良好的代表性和分辨力，可以进行从属到种及亚种、株系和致病型的鉴定。曾被描述为获取基因组指纹图谱的黄金方法。

DNA的限制性内切酶酶切反应技术缺点：操作繁琐、需要相对大量的纯培养物、需要时间长

(4d)、不适合于大量样品的高通量分析，且需要专门的

PFGE电泳设备。2.1.3PCR—RT定义与原理：在已知背景序列信息的基础上设计引物，用

PCR扩增基因组

DNA的特定部位，再用限制性内切酶将扩增出的片段酶切，利用酶切片断长度的多样性进行鉴别。在进行

PCR—RFLP分析时，一般选用保守的看家基因

HousekeepingGene序列如

rRNA基因、

recA基因序列等设计

PCR引物。其中

16SrRNA基因序列尤为常用。这时称为

ARDRA(AmplifiedRibosomalDNARestrictionAnalysis)或

Ribo-typing。2.1.4REP-PCR定义和原理：利用在细菌中发现的分散在整个基因组中的非编码的重复序列设计

PCR引物，可以选择性地扩增基因组的特定区域，进而得到DNA

指纹图谱。优点：很强的分辨力、高可靠性和可重复性，图谱最稳定，而且方法简便易行，测试大量样品时成本低。要求纯菌样品。已于医学、农业、工业和环境微生物的分类鉴定和流行病学研究2.1.5AFLPAFLP(Amplified-Fragmentlengthpolymorphism)技术巧妙地将限制性酶切的分辨力和

PCR的扩增能力结合在一起，原理上却与传统的

PCR-RFLP不同。

PCR-RFLP仅仅是对整个基因组的特定的一小部分取样

;AFLP则是对整个基因组进行取样分析，因而其代表性和分辨率要比PCR-RFLP高许多。2.1.6质粒DNA指纹图谱

质粒是细菌、支原体和植原体中存在的独立于基因组

DNA之外的双链闭环

DNA。鉴于此。质粒

DNA般不用作种及种以上的分类指标。不过也有例外的情况。有些质粒在宿主中特别稳定，许多质粒都携带增强宿主致病力的基因和抗生素抗性的基因。因此，质粒

DNA序列是进行病原微生物株系或致病型分类的重要指标。2.1.7基因组测序和16SrDNA测序基因组测序：对于基因组很小的微生物如一些病毒、特别是类病毒，基因组测序分类是可行的，甚至是惟可行的方法。16SrDNA测序：对于真菌、细菌、支原体和植原体等其他大多数

微生物而言，进行

16SrDNA测序分类是较理想的方法。RNA是由

DNA转录而来的，因此

RNA指纹图谱从本质上讲就是另一种形式的

DNA

指纹图谱

。微生物细胞中存在多种

RNA，如

rRNA、

mRNA、

tRNA和

hn-RNA等。其中

rRNA又分为

23SrRNA、

16SrRNA和

5SrRNA(原核生物)。目前用于病原微生物鉴定的主要是低分子量

RNA指纹图谱，即SLMW(stablelowMolecularWeight)RNAprofile。其中5SrRNA区带可以区分属

;tRNA区带可以用于种的鉴定。2.2RNA

指纹图谱蛋白质指纹图谱

中的多位点同功酶凝胶电泳图谱分析用于病原微生物

的分类鉴定。耗时较长，需要相对大量的分析样品，图谱结果不像

DNA和

RNA

指纹图谱那样易于解释。2.3蛋白质指纹图谱2.4.1脂肪酸指纹图谱分析

(FattyAcidProfileAnalysis，

FAPA)是提取细菌细胞中的全部脂肪酸，经气相色谱分离鉴定，得到不同类型脂肪酸的构成比例。在标准化的培养条件下，不同种类的细菌的各种脂肪酸的构成和比例不同而且是相对恒定的，因此可以用于分类鉴定。2.4其他生物大分子指纹图谱2.4.2生物大分子红外光谱

(Bio-FTIR)细菌是由蛋白质、核酸、多糖、脂肪和无数的小分子组成的。不同种类的细菌由于组成成分不同，其红外光谱也相应不同，因而可以区别。应用傅里叶变换红外光谱(FourierTransformInfraredSpectrometry，

F1m)方法结合多元分析手段，可以实现对细菌进行分类鉴定，并能在种甚至株系的水平上进行鉴定。2.4.3基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

MALDI-TOF–MS：可以用于微生物

的快速鉴定。细菌表面蛋白的种类和分布谱可以作为细菌鉴定的指纹图谱。3.1指纹图谱的分离3.1.1常规琼脂糖凝胶电泳(AE)是DNA

指纹图谱的分离的最简单技术。3.1.2聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)主要用于小片段

DNA、

RNA和蛋白质的分离。3.1.3脉冲电场凝胶电泳：在脉冲电场下进行的电泳称为脉冲电场凝胶电泳

PFGE(PulsedFieldGelElectrophoresis)。3.指纹图谱的分离及检测技术琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳PFGE3.1.4二维/2D凝胶电泳：一维是基于蛋白质的等电点不同而分离的等电聚焦技术；二维是基于蛋白质的分子量不同而分离的常规凝胶电泳技术。3.1.5毛细管电泳(Capillaryelectrophoresis，CE)是离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或

(和

)分配系数不同进行高效、快速分离的一种新电泳技术。2D凝胶电泳毛细管电泳样品个数不多时，对于只包含几条带的指纹图谱，用肉眼即可分析判别。样品数目多时，特别是谱带复杂时，就应采用软件进行分析。高质量的2D蛋白质电泳可产生上万个蛋白点，需用软件分析。用软件分析的优点是可以采用不同的数学算法进行定量和定性分析，分析结果可以以二维或三维方式输出，并进行分类树构建，非常直观。应当注意的是采用软件进行图谱分析时，必须使用高质量的图谱，并设定恰当的分析参数。对于质量较差的图谱一般需要在正式分析前进行背景扣除、谱带增强和泳道矫正等预处理，否则，将使分析结果的准确性下降，甚至可能使分析结果变得毫无意义。可进行

lD和

2D凝胶分析的软件众多，著名的

lD凝胶分析的软件有

AppiedMaths公司的

Ge