第二章 微生物常规鉴定技术

第二章微生物常规鉴定技术一、接种、分别纯化和培育技术二、形状构造和培育特性察看三、生理生化实验四、血清学检验第一节微生物检验根本知识一接种将微生物接到适于它生长繁衍的人工培育基上或活的生物体内的过程叫做接种。

１接种工具和方法接种和分别工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１〕划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培育基外表作来回直线形的挪动，就可到达接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。２〕三点接种在研讨霉菌形状时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板外表上，成等边三角形的三点，让它各自独立构成菌落后，来察看、研讨它们的形状。除三点外，也有一点或多点进展接种的。３〕穿刺接种在保藏厌氧菌种或研讨微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培育基普通是半固体培育基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培育基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，那么在穿刺线周围可以生长。４〕浇混接种该法是将待接的微生物先放入培育皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培育基，迅速悄然摇匀，这样菌液就到达稀释的目的。待平板凝固之后，置适宜温度下培育，就可长出单个的微生物菌落。５〕涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在外表作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。６〕液体接种从固体培育基中将菌洗下，倒入液体培育基中，或者从液体培育物钟，用移液管将菌液接至液体培育基中，或从液体培育物中将菌液移至固体培育基中，都可称为液体接种。

７〕注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。８〕活体接种活体接种是专门用于培育病毒或其它病原微生物的一种方法，由于病毒必需接种于活的生物体内才干生长繁衍。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。２无菌操作培育基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具〔如接种针和吸管等〕在无菌条件下接种含菌资料〔如样品、菌苔或菌悬液等〕于培育基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必需是无菌操作。斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞二分别纯化含有一种以上的微生物培育物称为混和培育物〔Mixedculture〕。假设在一个菌落中一切细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培育〔Pureculture〕。在进展菌种鉴定时，所用的微生物普通均要求为纯的培育物。得到纯培育的过程称为分别纯化，方法有许多种。1稀释平板法〔倾注法和涂布法〕2划线法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法3富集培育法富集培育法的方法和原理非常简单。我们可以发明一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需求的微生物能有效地与其他微生物进展竞争，在生长才干方面远远超越其他微生物。假设要分别一些专性寄生菌，就必需把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。经过多次反复移种便可以得到纯的寄生菌。4厌氧法石蜡法：厌氧培育箱法:亨盖特滚管法：三培育1、根据培育时能否需求氧气，可分为好氧培育和厌氧培育两大类。２、根据培育基的物理形状，可分为固体培育和液体培育两大类。第二节微生物常规鉴定技术一形状构造和培育特性察看１、微生物的形状构造察看主要是经过染色，在显微镜下对其外形、大小、陈列方式、细胞构造〔包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等〕及染色特性进展察看，直观地了解细菌在形状构造上特性，根据不同微生物在形状构造上的不同到达区别、鉴定微生物的目的。２、细菌细胞在固体培育基外表构成的细胞群体叫菌落〔colony〕。１〕细菌的培育特征包括以下内容：在固体培育基上，察看菌落大小、形状、颜色〔色素是水溶性还是脂溶性〕、光泽度、透明度、质地、隆起外形、边缘特征及迁移性等。在液体培育中的外表生长情况〔菌膜、环〕混浊度及沉淀等。半固体培育基穿刺接种察看运动、分散情况。２〕霉菌和酵母菌的培育特征：

大多数酵母菌没有丝状体，在固体培育基上构成的菌落和细菌的很类似，只是比细菌菌落大且厚。液体培育也和细菌类似，有均匀生长、沉淀或在液面构成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培育基里，菌丝无限伸长沿培育基外表蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因此菌落边缘和中心，正面和反面颜色经常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培育外表构成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。二生理生化实验微生物生化反响：指用化学反响来测定微生物的代谢产物，生化反响常用来鉴别一些在形状和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反响是微生物分类鉴定中的重要根据之一。１糖酵解实验不同微生物分解利用糖类的才干有很大差别，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。

实验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培育物少许，接种于发酵液体培育基管，假设为半固体培育基，那么用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培育，每天察看结果，检视培育基颜色有无改动〔产酸〕，小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，假设为半固体培育基，那么检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，假设有动力、培育物可呈弥散生长。本实验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵才干，从而进展各种细菌的鉴别，因此每次实验，常需同时接种多管。普通常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝等指示剂。２淀粉水解实验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。实验方法：以18~24h的纯培育物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板〔一个平板可分区接种，实验数种培育物〕或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培育24~48h，或于20°培育5天。然后将碘试剂直接滴浸于培育外表，假设为液体培育物，那么加数滴碘试剂于试管中。立刻检视结果，阳性反响〔淀粉被分解〕为琼脂培育基呈深蓝色、菌落或培育物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反响那么无透明环或肉汤呈深蓝色。

留意：淀粉水解系逐渐进展的过程，因此实验结果与菌种产生淀粉酶的才干、培育时间，培育基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培育基pH必需为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保管于冰箱，因此以临用时制备为妥。３甲基红〔MethylRedMR〕实验与V-P(Voger—Proskauer)实验1)．培育基：缓冲葡萄糖蛋白胨水磷酸氢二钾5克多胨7克葡萄糖5克蒸馏水1000毫升pH7.0溶化后校正pH，分装小试管，每管1毫升，高压灭菌121℃15分钟。2)．试剂：①甲基红试剂：甲基红0.1克，95％酒精300毫升，蒸馏水200毫升。先将甲基红溶于酒精中，然后参与蒸馏水。②6％a一萘酚酒精溶液，40％氢氧化钾溶液3)．实验自琼脂斜面挑取少量培育物接种于缓冲葡萄塘蛋白胨水中，36士1℃培育2～4天，哈夫尼亚菌那么应在22～25℃中培育，进展结果检查。

4)甲基红〔MethylRedMR〕实验与V-P(Voger—Proskauer)实验结果检查甲基红(MR)实验某些微生物如大肠杆菌，志贺氏菌、产气杆菌等，在糖代谢过程中产生丙酮酸，丙酮酸再进一步分解生成乙酸、乳酸、琥珀酸等。酸类添加愈多，那么培育基中的pH值愈下降，当降至pH4.5以下时，甲基红指示剂呈红色，即为阳性反响，如pH值高于4.5那么培育物呈黄色，即阴性反响。因此，在培育物中参与一滴甲基红试剂，立刻可察看上述结果。V—P(Voger—Proskauer)实验〔丙酮酸〕〔乙酰甲基甲醇〕〔二乙酰〕

〔胍〕〔红色化合物〕VP实验阳性〔红色〕阴性〔不变〕4.明胶液化实验〔1〕原理：某些细菌可产生一种胞外酶-明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体的明胶培育基成为流动的液体。〔2〕方法：将被检菌穿刺接种于明胶培育基，于22℃培育7d，逐日察看结果。假设用35℃孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在察看结果前，先置4℃冰箱内30min，再看结果。〔3〕结果：培育基呈液化形状为阳性。〔4〕运用：肠杆菌科细菌的鉴别，如沙雷菌、普通变形杆菌、奇特变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外多数假单胞菌也能液化明胶。5靛基质实验〔色氨酸〕〔靛基质〕某些微生物如大肠杆菌、变形杆菌、霍乱弧菌等含有色氨酸酶，能分解培育基中的色氨酸，产生靛基质(indolo)。当它与对二甲氨基苯甲醛(P—dimethylaminobenaldehyde)作用，构成玫瑰靛基质(rosindole)而呈红色。吲哚实验阴性〔液面黄〕阳性〔液面红〕实验方法：试剂：L一色氨酸0.1克0.01MpH6.8磷酸缓冲盐水100毫升储存于4℃方法：在上述试剂中参与大量纯培育菌，使成悬液，置36士l℃水浴中l小时，然后滴加对二甲基氨基苯甲醛液，察看结果。结果：阳性者在液面呈粉红色至玫瑰红色。

6硫化氢实验某些微生物(如沙门氏菌、变形杆菌等)能分解蛋白质中的含硫氨基酸(如胱氨酸、半胱氨酸等)产生硫化氢，硫化氢遇到铅盐或铁盐，那么发生作用而生成黑色的硫化铅或硫化铁。COOHCHNH2CH2S·SCH2NH2COOH+4H2→2H2S+2NH3+2CH3COOH+2HCOOHH2S+Pb(CH3COO)2→PbS↓+2CH3COOH(硫化氢)(醋酸铅)硫化铅(黑色沉淀)培育基配制及实验方法见GB4789.28中2.14(微量快速法)：试剂：盐酸半胱氨酸0.1克0.02MpH7.0磷酸缓冲盐水100毫升储存于4℃方法：取上述试剂0.4毫升，挑取一环纯培育物，制成悬液，于管口棉塞间夹一条醋酸铅试纸(不可接触试剂)，于36士1℃中每15分钟察看一次，直至1小时终了。结果：试纸条呈棕色至黑色为阳性。

7尿素酶实验尿素酶实验阴性〔黄〕阳性〔红〕尿素酶实验阴性〔黄〕阳性〔红〕培育基配制及实验方法见GB4789.28中2.15(微量快速法)：试剂：尿素10克0.2MpH6.5磷酸缓冲液100毫升0.4％酚红液取10％尿素液100毫升,参与0.4％酚红液0.6毫升,于4℃保管,试剂的颜色为黄色，如变成淡红色，阐明尿素已被分解，不宜运用。方法：取一灭菌试管。参与上述试剂0.2毫升，再参与一环纯培育体，于36士1℃培育10~30分钟察看结果。结果：呈淡红色为阳性。8.氨基酸脱羧酶实验

〔1〕原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺〔赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺〕和二氧化碳，使培育基变碱。使指示剂显示出来。〔2〕培育基：氨基酸脱羧酶培育基和氨基酸对照培育基。〔3〕方法：将被检菌分别接种于赖氨酸〔或鸟氨酸或精氨酸〕培育基和氨基酸对照培育基中，并参与无菌液体石蜡或矿物油，于35℃培育1～4d，每日察看结果。〔4〕结果：对看管应呈黄色，测定管呈紫色〔指示剂为溴甲酚紫〕为阳性，假设测定管呈黄色为阴性。假设对看管呈现紫色那么实验无意义，不能作出判别。〔5〕运用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其他沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴性。

9硝酸盐复原实验某些微生物如沙门氏菌能使硝酸盐复原为亚硝酸盐，在酸性环境下，亚硝酸盐可与氨基苯磺酸结合成重氮盐，假设再遇a一萘胺可构成红色偶氮化合物。培育基及试剂的配制,实验方法及结果察看见GB4789.28—2003.2.17试剂；硝酸钠0.05克溶于0.025MpH6.8磷酸缓冲液中，于4℃保管。方法：取试剂0.2毫升装一支小试管内，取一环纯培育物，制成悬液，置36士1℃培育1小时，然后参与甲液和乙液各0.2毫升，立刻察看结果。结果：阳性者呈红色。10过氧化氢酶实验某些微生物能产生过氧化氢酶，将过氧化氢分解而放出氧气。过氧化氢酶2H2O2一一→2H20+02↑(气泡)多数需氧或兼性厌氧微生物皆能产生过氧化氢酶，而普通厌氧微生物不产生此酶．试剂：3％过氧化氢溶液方法：取一环纯培育体置于干净的小试管内，滴加3％过氧化氢液2毫升，30秒钟内产生气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。11氧化酶实验〔1〕原理：氧化酶〔细胞色素氧化酶〕是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。〔2〕试剂：1％盐酸四甲基对苯二胺或1％盐酸二甲基对苯二胺。试剂配制及实验方法见GB4789.28--2021．2.18〔3〕方法：常用方法有三种；1〕菌落法：直接滴加试剂于被检菌菌落上。2〕滤纸法：取干净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。3〕试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。〔4〕结果：细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。为保证结果的准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。〔5〕运用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反响。12三糖铁〔TSI〕琼脂实验实验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培育物，穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃培育18~24h，察看结果。本实验可同时察看乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气〔变黄〕；产生硫化氢〔变黑〕。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培育基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧形状下，酸类不被氧化，所以仍坚持黄色。提问：志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。应该产生什么景象？大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳