当归多糖以Galectin-3为靶点诱导白血病细胞凋亡的构效关系研究

当归多糖以Galectin-3为靶点诱导白血病细胞凋亡的构效关系研究目的:当归Angelicasinensis（Oliv.）Diels作为祖国的传统中药应用于血液疾病和妇科疾病等的治疗由来已久。多糖为当归的主要活性成分之一,研究发现当归多糖具有显著的抗氧化、抗肿瘤、促进造血、免疫调节、防辐射等生物活性。已有文献报道,当归多糖对白血病细胞增殖可产生显著的抑制,并诱导其凋亡,在治疗白血病过程中发挥了攻补兼施的独特疗效。本课题组前期研究也表明,当归酸性多糖（特别是AAPS-2Ⅰ组分）有对白血病细胞增殖的直接抑制作用,且较当归中性多糖组分强。此外,前期实验也提示,Galectin3（Gal-3）可能是当归多糖诱导白血病细胞发生凋亡的作用靶点。本课题拟通过1)分析活性多糖AAPS-2Ⅰ的结构特征;2)建立AAPS-2Ⅰ多糖片段的制备方法,制备AAPS-2Ⅰ的酶降解和酸水解片段;3)筛选可以与Gal-3结合的AAPS-2Ⅰ多糖片段;4)测定AAPS-2Ⅰ及其片段对白血病细胞K562增殖的抑制和凋亡的诱导作用;5)综合分析AAPS-2Ⅰ活性片段的结构特征与诱导白血病细胞凋亡的构效关系五个方面的研究层层深入解析当归酸性多糖AAPS-2Ⅰ抑制白血病K562细胞增殖,并诱导其发生凋亡的活性核心结构特征,进一步阐明AAPS-2Ⅰ发挥白血病细胞增殖抑制作用的靶点和治疗白血病的药效基础,为祖国传统医药的临床研究和新药的开发提供更多生物学实验数据和研究依据。方法:（1）AAPS-2Ⅰ的结构特征分析:HPSEC法测定当归酸性多糖AAPS-2Ⅰ的纯度和分子量,苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、考马斯亮蓝法分别测定AAPS-2Ⅰ的总糖含量、糖醛酸含量和蛋白含量,HPLC法测定AAPS-2Ⅰ的单糖组成,1D和2DNMR解析AAPS-2Ⅰ糖残基类型和连接方式;（2）AAPS-2Ⅰ多糖片段的制备:酶降解法和酸水解法分别制备AAPS-2Ⅰ的酶降解片段和酸水解片段;（3）固相结合法、MST法测定8种当归均一性多糖及AAPS-2Ⅰ多糖片段与Gal-3的亲和力;（4）CCK-8法测定8种当归均一性多糖及AAPS-2Ⅰ多糖片段对白血病细胞K562的增殖抑制,AnnexinV-FITC/PI双染法测定各均一性多糖及AAPS-2Ⅰ多糖片段作用后白血病细胞K562的凋亡率;（5）HPLC法测定AAPS-2Ⅰ活性片段的单糖组成,NMR分析AAPS-2Ⅰ活性片段的结构。结果:（1）HPSEC实验结果表明,AAPS-2Ⅰ为分子量6.5×10⁴Da的均一性多糖;AAPS-2Ⅰ的总糖含量,糖醛酸含量和蛋白含量分别为96.37%,36.87%和1.08%;其单糖组成及摩尔比Man︰Rha︰GalA︰Glc︰Gal︰Ara（0.2︰0.4︰0.2︰1.0︰3.9︰2.4）,此外,还含有痕量的GlcA和Fuc;NMR解析发现AAPS-2Ⅰ结构中主要含有α-L-1,5-Araf、α-L-1,3,5-Araf、T-α-Araf、β-D-1,4-Galp、β-D-1,3-Galp、T-α-Glcp、α-L-1,2-Rhap7种糖残基。（2）建立了AAPS-2Ⅰ酶降解和酸水解片段的制备工艺,分别用β-半乳糖酶、β-甘露聚糖酶、果胶酶和鼠李糖酶4种酶对AAPS-2Ⅰ进行降解,得到了Galase-1、Galase-2、Galase-3、Galase-4、Manase-1、Manase-2、Pecase-1、Pecase-2、Rhaase-1和Rhaase-2共10种酶降解片段;分别用0.5、1.0、2.0MTFA水解AAPS-2Ⅰ,透析得到3种酸水解片段AAPS-2Ⅰ-0.5-R、AAPS-2Ⅰ-1-R和AAPS-2Ⅰ-2-R。经纯化,获得的13种均一性降解片段分子量831.7².5×10⁴Da。（3）MST研究发现在8种当归均一性多糖中,AAPS-2Ⅰ、AAPS-2Ⅱ和AAPS-1Ⅰ可以与Gal-3结合,解离常数（Kd）分别为:93.5±33μM、510.3±106μM和166±4.46μM,AAPS-2Ⅰ酶水解片段中Galase-4、Pecase-1、Rhaase-2与Gal-3有结合,Kd分别为24.5±12μM、166.7±120μM和596±146μM,酸水解片段均与Gal-3无结合作用;固相结合实验进一步证实Galase-4、Pecase-1和Rhaase-2与半乳糖竞争性结合Gal-3,IC₅₀分别为179±18mg/L、182±17mg/L和189±29mg/L。（4）CCK-8法测定当归各均一性多糖及AAPS-2Ⅰ多糖片段对K562细胞的增殖抑制作用,结果显示在8种均一性多糖中,AAPS-2Ⅰ抑制作用最强,其酶降解片段Galase-4可进一步增加抑制作用,IC₅₀可达44.23mg/L,且呈浓度依赖性关系;AnnexinV-FITC/PI双染色法测定当归各均一性多糖及AAPS-2Ⅰ多糖片段对K562凋亡的影响,结果发现,AAPS-2Ⅰ可显著地诱导K562细胞发生凋亡,其酶降解片段Galase-4能进一步促进白血病细胞K562发生凋亡。（5）AAPS-2Ⅰ可能的糖链结构含有:→2)-Rhap-（1→3）-Galp-（1→）-T-Glcp,→5)-Arap-（1→4）-Galp-（1→,→5）-Araf-（1→3,5）-Araf-（1→3）-T-Araf;与Gal-3亲和作用最强的酶降解片段Galase-4结构中含有→3)-Galp-（1→4）-Manp-（1→主链,→4）-Glcp-（1→5）-Araf-（1→支链;AAPS-2Ⅰ-0.5-R主要的糖链连接方式为:→4）-Manp-（1→4）-Glcp-（1→）-GlcpA。通过比较AAPS-2Ⅰ及其活性片段、酸水解片段的单糖组成和糖链连接方式,初步确定当归多糖抗白血病的构效关系:酸性;GlcA和Rha为非必须糖残基;→3)-Galp-（1→4）-Manp-（1→主链,→5）-Araf-（1→支链是重要的活性单元;多糖酸化降解后活性丧失。结论:本研究初步解析了AAPS-2Ⅰ的结构特征,其主要含有α-L-1,5-Araf、β-D-1,4-Galp、β-D-1,3-Galp和α-L-1,2-Rhap糖残基;建立了AAPS-2Ⅰ酶降解和酸水解片段的制备工艺并制备得到了13种AAPS-2Ⅰ多糖片段;发现8种当归均一性多糖中,AAPS-2Ⅰ对白血病细胞K562的增殖抑制作用最为显著,可通过结合Gal-3产生白血病细胞凋亡诱导作用;其酶降解片段Galase-4对Gal-3的亲和力、K562细胞的凋亡率和增殖抑制作用均进一步增强,表明Galase-4是主要“活