豆豉姜抗类风湿性关节炎物质基础及作用机制研究

豆豉姜抗类风湿性关节炎物质基础及作用机制研究类风湿性关节炎（Rheumatoidarthritis，RA）是一种病因未知的慢性关节滑膜炎性疾病，可引起骨功能丧失和残疾，全球发病率达0.8%，可使患者寿命缩短并且需花费不菲的治疗费用。RA的主要病理特征为关节炎滑膜系统性炎症引起的关节软骨和骨侵蚀。中医理论中RA被定义为“痹症”，根据其病因又分为寒痹、湿痹和热痹，是由于人体正气不足、防御能力减弱而被风寒湿热之邪侵犯所引起。豆豉姜为樟科木姜子属植物山鸡椒Litseacubeba(Lour.)Pers的干燥根及根茎，又名澄茄根、木姜子根、山苍子根等，是傣药的一种，在《西双版纳傣药志》中记载为“沙海滕”，语意为“驱散消除病邪，使身体健康”之意，民间用于治疗类风湿性关节炎疗效非常显著，具有祛风散寒除湿，理气通络止痛的功效，主治“风湿痹痛，四肢麻木，腰腿痛，跌打损伤，感冒头痛，胃痛”等。现代化学及药理研究表明豆豉姜含有生物碱、木脂素、甾体等成分，其挥发油具有抗炎镇痛、抗菌、抗氧化、抗血栓等多种药理活性。在西南傣族地区，豆豉姜被用于治疗类风湿性疾病，临床上也有用豆豉姜治疗类风湿的报道，但其抗RA的药理作用和物质基础及作用机制尚不明确，限制了这一民族药物资源的进一步开发利用。因此，本论文对豆豉姜抗类风湿性关节炎活性进行了药效学评价，并对其化学成分进行了系统研究；对豆豉姜抗类风湿性关节炎活性部位二氯甲烷部位化学成分进行了体外抗炎活性研究和破骨细胞TRAP活性研究，筛选了具有抗炎活性和抑制破骨细胞TRAP活性的化学成分，并利用RT-PCR和westernblot技术对活性成分的抗炎机制进行初步研究；为了确定有效成分可能的作用靶点，利用分子对接技术对豆豉姜活性成分可能的抗类风湿性关节炎靶点进行了预测，然后通过CETSA技术对分子对接预测的活性成分及作用靶点进行实验验证，为了进行单体的体内药效研究和药代动力学研究，对活性成分进行全合成研究，具体如下：一、豆豉姜提取物体内抗类风湿性关节炎作用研究采用完全弗氏佐剂诱导Wistar大鼠关节炎模型（AdjuvantArthritis，AA），以足肿胀、关节炎指数、大鼠体重变化、免疫器官指数、外周血液单核细胞（PeripheralBloodMononuclearCells，PBMC）中环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）和5-脂加氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）表达水平及大鼠血清中关键细胞因子（TNF-α，IL-β，IL-6，IL-10）的表达为指标，考察豆豉姜提取物（200,50mg/kg）体内抗类风湿性关节炎的药效作用。结果显示，豆豉姜提取物高、低剂量（200,50mg/kg）都能显著抑制AA大鼠足肿胀，降低关节炎指数，显著降低胸腺指数，但对脾脏指数无显著影响。此外，豆豉姜提取物还能降低AA大鼠外周血单核细胞中炎症因子COX-2和5-LOX的含量，降低大鼠血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β，IL-6和升高抑炎因子IL-10的含量。大鼠后足关节病理切片显示豆豉姜提取物能改善AA关节炎引起的关节病变。同时考察了豆豉姜提取物各极性萃取部位的抗类风湿性关节炎作用，结果显示二氯甲烷部位高低剂量具有显著的抗类风湿性关节炎活性。综上所述，豆豉姜具有抗类风湿性关节炎药理作用，其活性部位为二氯甲烷部位，作用机制可能与其抗炎作用和免疫抑制作用有关。二、豆豉姜化学成分分离鉴定采用经典的天然产物分离方法：取干燥豆豉姜药材，粉碎过筛后用75%乙醇回流提取，提取液合并后减压浓缩，得到浸膏后用水混悬，然后按极性大小依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到不同极性的萃取部位，并利用硅胶，反相硅胶（ODS），凝胶，MCI和制备液相等多种分离方法和分离填料对各部位进行单体成分的分离。并利用质谱、核磁共振谱、紫外及红外等方法对所分化学成分进行结构鉴定。从豆豉姜中共计分离77个化合物，鉴定63个化合物，36个首分，其中1个新化合物，1个新的天然产物。化合物类型包括：木脂素、生物碱、甾体、苷类、异香豆素、酚酸、及其他小分子化合物。三、豆豉姜活性成分研究以LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型和破骨细胞TRAP活性模型考察豆豉姜二氯甲烷部位11个化学成分的体外抗炎活性和TRAP抑制活性。结果显示所测化学成分中有6个成分具有著的抗炎活性，其中LC43为新化合物豆豉姜素。LC36具有显著的TRAP抑制活性。四、豆豉姜活性成分抗炎机制初探本章内容从蛋白水平和基因水平对活性成分LC36和LC43可能的抗炎机制进行了初步研究。RT-PCR结果表明，LC36和LC43可显著抑制关键炎性蛋白酶iNOS和COX-2的mRNA表达。Westernblot分析结果显示，LC36和LC43可显著抑制NF-κB抑制蛋白IκBα及激酶IKKβ磷酸化，但是对p38和Akt蛋白磷酸化无显著影响。五、基于分子对接技术和CETSA技术的豆豉姜活性成分抗类风湿性关节炎靶点预测及验证通过文献调研，构建类风湿性关节炎关键靶蛋白库（p38MAKP，JAK，Syk，AP-1/c-Fos，c-JNK，CD80，A3AR，CathepsinK和MEK1），利用分子对接技术对豆豉姜中活性成分LC36和LC43与关键靶蛋白进行对接分析，结果显示在已知RA靶蛋白中LC36与p38MAPK，MEK1和cathepsinK具有较好的结合活性。利用CETSA细胞热转移技术对它们的结合进行实验验证，由CETSA曲线和等温量效曲线(ITDRFCETSA)可知，LC36在细胞内可与MEK1和cathepsinK结合。LC36具有双靶点作用，其作用靶点为MEK1和cathepsinK。六