木质纤维素高效降解的动物源机制

木质纤维素高效降解的动物源机制叶美瀛;陈雪;刘研萍【摘要】生物质资源在解决能源短缺和环境污染方面有着巨大的潜力,但生物质的低成本高效转化利用机制仍需进行深入研究.在动物源木质纤维素降解体系中,选取低等白蚁进行了系统分析,由于其体内具有高效转化木质纤维素系统,其肠道消化体系是一个非常高效的“生物反应器”.白蚁体内含丰富的木质纤维素降解酶系和高效微生物资源,在白蚁-共生微生物双重作用下,纤维素和半纤维素能够被高效降解.通过分子生物技术,可对纤维素酶和半纤维素酶进行异源表达,表达产物活性高.文章阐述了低等白蚁的木质纤维素降解酶系统,共生微生物的多样性及功能和高效降解木质纤维素机制,以及木质纤维素酶异源表达情况,为生物质低成本、系统的高效转化利用提供新的方向和思路.期刊名称】《中国沼气》年(卷),期】2016(034)002【总页数】6页(P18-23)【关键词】低等白蚁;木质纤维素降解酶;共生微生物;异源表达【作者】叶美瀛;陈雪;刘研萍【作者单位】北京化工大学环境科学与工程系,北京100029;北京国能中电节能环保技术有限责任公司,北京100020;北京化工大学环境科学与工程系,北京100029【正文语种】中文中图分类】S216.4;TQ35木质纤维素主要是由纤维素，半纤维素和木质素组成，是地球上最丰富的可再生资源，具有生物燃料和生物材料生产的潜力［1］。木质纤维素由于结构复杂，纤维素晶体高度有序，与半纤维素交杂在一起，被性质稳定的木质素包裹起来，而难以被酶和微生物降解，导致其降解率一直不高。在自然界中，存在许多生物能够以木质纤维素为食来获取营养物质和能量，白蚁就是一类最具代表性的动物，大约2600种白蚁广泛分布在世界范围［2］。据估计，白蚁每年大约可消耗3~7亿吨的木质纤维素，能高效消化79%~99%的纤维素，对热带和亚热带地区生态系统的碳循环起着非常重要作用［3］。低等白蚁占总白蚁种类的25%，共有6个科，分别为草白蚁科、原白蚁科、澳白蚁科、木白蚁科、齿白蚁科和鼻白蚁科［4］，在我国长江以南城市广泛分布存在，典型的有家白蚁、散白蚁、木白蚁和原白蚁等［5］。与高等白蚁相比，低等白蚁进化不完全，取食范围略窄，它们喜欢取食富含木质纤维素的食物，包括一些草本植物和树木等活植物及干枯植物。白蚁能高效降解木质纤维素主要原因是其肠道消化系统是一个高效的“生物反应器”，其体内含有大量能表达木质纤维素酶的基因，以及大量微生物在后肠共生存在，在白蚁自身及共生体的双重作用，木质纤维素被充分分解利用［6］。低等白蚁既是害虫，也是资源型昆虫，其体内相关木质纤维素降解酶及微生物具有重大的研究价值，对木质纤维素降解工艺的设计具有启发意义。文章系统的分析了低等白蚁的木质纤维素降解酶体系、木质纤维素酶的异源表达、肠道微生物的多样性以及木质纤维素的体内转化过程。低等白蚁能高效降解木质纤维素，主要原因是其体内具有丰富的降解木质纤维素相关酶种类，包括内切葡聚糖酶（EC321.4，简称EG酶）、外切葡聚糖酶（EC3.2.1.91,也称CBH酶）和葡聚糖苷酶（EC3.2.1.21,简称BG酶）3种纤维素酶，以及木聚糖酶、甘露聚糖酶等半纤维素酶［7］。酶系来源包括白蚁自身产生的内源性纤维素酶和共生微生物产生的木质纤维素降解酶。白蚁自身产生的内源性纤维素酶低等白蚁自身能产生的内源性纤维素酶一EG酶和BG酶，主要是在唾液腺表达分布。Inoue［8］等人研究北美散白蚁体内纤维素酶时发现77.8%的EG酶和23.9%的BG酶分布在唾液腺中。80%的EG酶活性分布在台湾乳白蚁的唾液腺中，而在中肠也分布相对较少的EG酶活性［9］［10］。关于BG酶，Zhang［11］等人用基因转录检测证实了唾液腺是BG酶主要表达场所。在恒春新白蚁的唾液腺中检测到75%BG酶活性分布，15%BG酶活分布在共生着大量鞭毛虫的后肠部位［12］。在低等白蚁前肠及中肠都能检测到少量的纤维素酶，一种可能原因是部分由唾液腺产生的纤维素酶随木质纤维素转移到前肠和中肠部位。在GenBank收录的纤维素酶基因中，根据肽序列相似性对白蚁内源性纤维素酶进行分类，所有的EG酶属于GHF9，而内源性BG酶属于GHF1［13］。共生微生物产生的木质纤维素降解酶纤维素酶与内源性纤维素酶相比，低等白蚁后肠的共生原生动物能产生更复杂的纤维素酶。EG梅，BG梅和CBH梅3种纤维素酶均能在白蚁后肠检测到。众多学者利用生物学技术，在原生动物体内发现了大量的纤维素酶的基因，不同白蚁后肠的原生动物能够克隆出的纤维素酶基因种类具有差异。台湾乳白蚁后肠存在3种鞭毛虫S.leidyi，H.mirabile和P.grassii，能够从中克隆到不同的纤维素酶基因，分别有GHF5EG［13］，GHF7EG［14］和GHF7CBH［15］。杜蕾蕾［16］通过RT-PCR和RACE技术克隆了黑胸散白蚁后肠鞭毛虫的纤维素酶基因，经分析该基因属于糖基水解酶家族7(GHF7)。近年来宏转录组学技术广泛运用生物学研究，从低等白蚁后肠微生物获得了众多纤维素酶基因序列信息。Todaka［17］等人对台湾乳白蚁、达尔文澳白蚁、恒春新白蚁和H.sjostedti原白蚁四种低等白蚁后肠共生原生动物建立了cDNA文库并进行EST分析，可以得知GHF5EGs,GHF7EGs,GHF7CBHs和GHF45EGS是共生体纤维素酶系统的主要作用酶；其中GHF45EGS是达尔文澳白蚁共生原生动物的核心纤维素酶，而在恒春新白蚁后肠未检测到其序列（见表1）。半纤维素酶白蚁能高效消化半纤维素，主要是由其后肠共生微生物产生的木聚糖酶等半纤维素酶在起作用。Azuma［18］等人喂食黄胸散白蚁工蚁，在喂食木聚糖21天后，显示白蚁后肠的一些原生动物仍能存活并保持着木聚糖酶活性，表明了木聚糖酶活性与后肠原生动物息息相关。Smith和Koehler［19］研究木聚糖含量不同的食物对白蚁体内木聚糖酶的影响，发现食物的木聚糖含量越高，测得的木聚糖酶越高，其中超过92%的木聚糖酶活性位于后肠，证明了木聚糖的消化主要由后肠共生微生物在起作用。Arakawa［20］等人第一次从台湾乳白蚁提纯到三种具有相同功能的木聚糖酶，克隆相应的cDNAs显示这些木聚糖酶隶属于GHF11,运用反转录-PCR技术证实相应的表达基因源自后肠全鞭毛虫。由于木聚糖体外提纯困难，提供信息不足，无法全面了解白蚁体内半纤维酶基因。近年来广泛运用宏转录组学技术来发现并分析白蚁体内半纤维素酶基因，对常见的低等白蚁进行检测，发现木聚糖酶基因主要是由白蚁后肠细菌及原生动物产生的，而白蚁能否自身分泌尚未得知（见表2），检测到的半纤维素酶主要属于GHF10和GHF11。在鼻白蚁科中，GHF10木聚糖酶相对含量较少，起主要作用的是GHF11木聚糖酶［21］。1.3低等白蚁木质纤维素酶的异源表达白蚁体内的木质纤维素酶要实现工业应用，进行异源表达大量生产重组酶是非常有必要的。在国外，有关白蚁自身及其体内共生体的木质纤维素酶基因体外表达的研究报道很多，EGs，BGs和木聚糖酶异源高效表达，而国内鲜有报道。白蚁自身及其体内共生原生动物存在大量的纤维素酶基因，异源表达获得的重组纤维素酶活性高。Zhang［28］等人从台湾乳白蚁自身肠道克隆到cfEG5（GHF9）并在大肠杆菌表达，结果显示重组EG酶的比活力达到325U・mg-1。从栖北散白蚁R.speratus后肠共生原生动物克隆到一个GHF7EG基因并在米曲霉表达，重组EG酶具有高比活力(603U・mg-1)，在pH值6.5和温度45°C条件下，酶活性最高；以CMC底物重组EG酶的米氏常数Km和Vmax分别为1.97mg・mL-1和769.6U・mg-1［29］。Ni［30］等人将从恒春新白蚁的唾液腺中获得的NkBG基因第一次在大肠杆菌异源表达，其重组BG酶的性质基本与白蚁体内BG酶一致，作用于纤维二糖的Km和Vmax分别为3.8mM和220U・mg-1,最适pH值和温度分别为5.0和45C,比活力达到156.7U・mg-1。对于重组木聚糖酶，Matteotti［31］等人根据功能活性筛选从散白蚁R.santonensis的革兰氏阳性细菌克隆了一个木聚糖酶基因(XylB8),XylB8(GHF11)在大肠杆菌异源表达，获得的重组木聚糖酶作用于山毛榉材木聚糖，在pH值5.0和55C下有最大酶活性，Km和Vmax分别为9mg・mL和3333U・mg-1。Tsukagoshi［32］等人第一次从栖北散白蚁R.speratus的共生原生动物克隆到GHF26甘露聚糖酶RsMan26H并在酵母菌表达，经过184h培养后，蛋白质浓度最终达到0.67g・L-1,对于底物可溶豆胶半乳甘露聚糖，最适pH值和温度分别为5.0和40C，该酶能够作用于低聚糖或多糖产生甘露二糖。低等白蚁体内共生着大量的原生动物和古细菌、螺旋体等原核生物，对白蚁代谢活动和物质循环起着重要的作用。在以下对低等白蚁肠道内的原生动物和原核生物的多样性及功能进行分析。白蚁后肠原生动物的多样性及功能低等白蚁后肠定居着大量的共生鞭毛虫，在木质纤维素消化降解过程起着重要的作用。白蚁共生的鞭毛虫均属于超鞭毛虫目、毛滴虫目和锐滴虫目［33］。鞭毛虫可达到白蚁总体重的1/7至1/3，在后肠肠液占有相对较大的体积空间，低等白蚁种类不同，其肠道内的鞭毛虫种类具有差异，台湾乳白蚁肠道内共生着3种鞭毛虫，而栖北散白蚁至少存在11种［34］。鞭毛虫是低等白蚁不可或缺的存在，一方面鞭毛虫与白蚁存在共生关系；另一方面，鞭毛虫与细菌或古生菌存在内(外)共生关系。低等白蚁一旦缺失鞭毛虫就无法存活，鞭毛虫群落的改变会影响白蚁体内木质纤维素酶的活性，引起共生原核生物群落发生变化［35］。毛滴虫目和超鞭虫目的鞭毛虫含有氢化酶体(Hydrogenosomes)，以底物水平磷酸化的形式产生ATP并释放乙酸，供白蚁代谢需要的能量。同种白蚁肠道的3种鞭毛虫在消化木质纤维素过程起不同的作用，最大的鞭毛虫(P.grassii)主要消化高度聚合的纤维素，而较小的鞭毛虫Holomastigotoideshartmanni和Spirotrichonymphaleidyi则降解低分子量的纤维素［36］。在近年来，广泛运用宏转录组学技术研究低等白蚁共生微生物，其中，鞭毛虫来源的SSUrRNA占了77.9%，从鞭毛虫克隆出了许多纤维素酶基因，如GHF5EGS，GHF7CBHS和GHF45EG等，证实了鞭毛虫能够降解木质纤维素［23］。白蚁体内共生原核生物的多样性及功能低等白蚁后肠肠液及鞭毛虫细胞液存在着大量的细菌和古生菌等原核生物。从低等白蚁肠道已分离到多种好氧菌及兼性厌氧菌，但细菌菌落的难培养性，只有少部分原核生物被认知。现在主要是依靠非培养式分子技术如对16SrRNA基因测序来研究原核生物的多样性，经系统发育分析发现低等白蚁共生细菌的主要类群有螺旋体、变形菌、厚壁菌、拟杆菌、放线菌和白蚁菌群1［37］。优势菌群因白蚁种类而有所差异，散白蚁属最占优势的是螺旋体，而在乳白蚁的最优势菌是拟杆菌［38］。原核生物在低等白蚁肠道中的分布是不均匀的，有的与鞭毛虫共生，有的游离生活于肠腔，还有的密布于后肠肠壁。螺旋体在白蚁后肠肠道游离或粘附在鞭毛虫表面，分离纯化得到的螺旋体具有还原产乙酸作用，能够消耗H2/CO2还原合成乙酸［39］。产甲烷古菌在低等白蚁后肠肠道含量相对较少，与螺旋体竞争利用二氧化碳和氢气，还原反应生成甲烷［40］。同时，低等白蚁后肠还存在着固氮菌、硫酸盐还原细菌、尿酸分解菌等，参与白蚁代谢活动和物质循环［41］。在国内外，尽管分离纯化得到了许多能降解木质纤维素的原核生物，或通过宏转录组学和PCR-DGGE等技术了解了其多样性，但它们在白蚁体内所起的具体作用仍未明确，相互作用关系有待进一步研究。低等白蚁肠道及内环境白蚁肠道是结构化不断变化的微环境系，生理状态和微生物群落结构具有明显差异，是木质纤维素降解的主要场所。白蚁肠道通常由前肠，中肠和后肠组成（见图1）。前肠起源于外胚层，包含一段食道，膨大的前段（“嗉囊”）和后段（“砂囊”），主要作用是机械研磨白蚁摄入的木质碎片；中肠呈柱状，起源于内胚层，是消化酶分泌和营养吸收的主要场所；中肠和后肠的连接处是马氏管，具有排泄代谢废物的功能；经过部分消化的木质纤维素进入到白蚁肠道最大的部分—后肠，其长度和结构复杂多变，细分可以分为P1，P2，P3,P4和P5五部分，是新陈代谢的主要场所［42］。后肠P3部分显著膨大，生存着大量的细菌、古生菌和原生动物。膨大的肠道区域减缓了物质在肠道的运输，延长了消化物与肠道微生物的接触时间，这也是白蚁能高效降解木质纤维素的一种原因。起初白蚁的后肠被认为是一个厌氧环境，后来严格好氧菌及兼性厌氧菌的发现否定了这观点，微电极技术的应用证实了白蚁肠道是一个渐变的系统，氢氧分压在白蚁肠道空间上分布呈明显的梯度变化，氧分压在肠壁部位高而中心部位很低，而氢分压而相反［38］。这样的渐变系统影响微生物群落及其活性在微尺度下呈现多样性的分布变化。低等白蚁肠道pH值呈弱酸性，有利酶类和微生物作用木质纤维素。木质纤维素在低等白蚁体内的转化过程低等白蚁消化降解木质纤维素的过程可以看作机械预处理、酶水解和微生物综合处理的过程。白蚁上颚和前胃能够剪切或挤压摄入的食物，降低物质粒径，能使木质颗粒在前肠和后肠尾部区间达到20~100pm不等长度，是一个机械预处理的过程［10］。白蚁唾液腺能分泌内源性纤维素酶，这些酶与木质物质充分混合，在转移到前肠和中肠的过程中进行酶水解产生纤维素碳水化合物和一些可溶性糖类（葡萄糖和纤维二糖），部分可溶性糖类在中肠被白蚁吸收［44］。木质纤维素主要是在白蚁后肠降解的，主要是由于白蚁后肠肠腔共生着大量的鞭毛虫及原核生物，二者能协同作用降解转化木质纤维素（见图2）。在白蚁后肠，从肠壁到后肠中心，氢分压逐渐升高，而氧分压恰相反，这影响了微生物群落的分布。鞭毛虫能分泌大量的纤维素酶和半纤维酶作用于部分水解的木质纤维素生成单糖，并被鞭毛虫和共生原核生物利用以底物水平磷酸化形式生成乙酸、H2和。与鞭毛虫胞内（外）共生的产甲烷菌和螺旋体等细菌竞争消耗H2，产甲烷菌还原CO2生成甲烷（4H2+CO2-CH4+2H2O）,同型产乙酸菌还原CO2生成醋酸（4H2+2CO2-CH3COOH）;在有氧条件下，耐氧乳酸菌将由鞭毛虫分解产生的单糖发酵为乳酸；其他类型VFAs产生机制未知，但离不开细菌群落的作用，产生的短链脂肪酸被白蚁吸收［36，44］。另外，白蚁后肠还存在固氮菌、硫酸盐还原细菌、尿酸分解菌等菌落，参与白蚁代谢活动和物质循环。白蚁自身及微生物产生的特定木质纤维素降解酶系在与体内共生微生物的协同作用下，木质纤维素被高效降解利用，但具体的降解机制仍未完全清楚，还需进一步研究。我国具有丰富的生物质资源，但一直面临转化效率不高的问题。白蚁是一座值得挖掘开发的宝库，其肠道消化系统是个非常高效的“生物反应器”，对木质纤维素具有非凡转化利用能力，远超现有任何技术。白蚁的“机械预处理-复合酶水解-微生物降解”高效转化木质纤维素机制，对攻克生物质利用的关键技术和理论方面具有极大的科学借鉴价值。白蚁体内高效木质纤维素降解酶系统资源值得挖掘及其工程化利用，对高效微生物资源进行筛选、改造与利用。白蚁独特的高效生物质转化的能力及其背后的生物作用机制、理化作用原理及其物态演变的规律被揭开，人们就能够通过现代生物技术与工程技术相结合，对这一机制和过程进行模拟，构建一个仿生集成系统，实现生物质高效转化的过程化利用。【相关文献】HimmelME,DingSY,JohnsonDK,etal.Biomassrecalcitrance:engineeringplantsandenzymesforbiofuelsproduction[J].science,2007,315(5813):804-807.EggletonP.Anintroductiontotermites:biology,taxonomyandfunctionalmorphology[M].Biologyoftermites:amodernsynthesis.SpringerNetherlands,2011:126.BreznakJA,BruneA.Roleofmicroorganismsinthedigestionoflignocellulosebytermites[J].Annualreviewofentomology,1994,39(1):453-487.LoN,EggletonP.Termitephylogeneticsandco-cladogenesiswithsymbionts[M].SpringerNetherlands,Biologyoftermites:amodernsynthesis,2011:27-50.⑸蔡邦华,陈宁生•中国白蚁分类和区系问题J].昆虫学报,1964,1:25-37.NakashimaK,WatanabeH,SaitohH,etal.Dualcellulose-digestingsystemofthewood-feedingtermite,CoptotermesformosanusShiraki[J].InsectBiochemistryandMolecularBiology,2002,32(7):777-784.NiJ,TokudaG.Lignocellulose-degradingenzymesfromtermitesandtheirsymbioticmicrobiota[J].Biotechnologyadvances,2013,31(6):838-850.InoueT,MurashimaK,AzumaJI,etal.CelluloseandXylanUtilisationintheLowerTermiteReticulitermessperatus[J].Journalofinsectphysiology,1997,43(3):235-242.NakashimaK,AzumaJ.Distributionandpropertiesofendo-p-1,4-glucanasefromalowertermite,Coptotermesformosanus(Shiraki)[J].Biosciencebiotechnologyandbiochemistry,2000,64(7):1500-1506.FujitaA,HojoM,AoyagiT,etal.DetailsofthedigestivesysteminthemidgutofCoptotermesformosanusShiraki[J].Journalofwoodscience,2010,56(3):222-226.ZhangD,AllenAB,LaxAR.Functionalanalysesofthedigestivep-glucosidaseofFormosansubterraneantermites(Coptotermesformosanus)[J].Journalofinsectphysiology,2012,58(1):205-210.TokudaG,SaitoH,WatanabeH.Adigestivep-glucosidasefromthesalivaryglandsofthetermite,Neotermeskoshunensis(Shiraki):distribution,characterizationandisolationofitsprecursorcDNAby5'-and3'-RACEamplificationswithdegenerateprimers[J].Insectbiochemistryandmolecularbiology,2002,32(12):1681-1689.InoueT,MoriyaS,OhkumaM,etal.Molecularcloningandcharacterizationofacellulasegenefromasymbioticprotistofthelowertermite,Coptotermesformosanus[J].Gene,2005,349:67-75.WatanabeH,NakashimaK,SaitoH,etal.Newendo-p-1,4-glucanasesfromtheparabasaliansymbionts,PseudotrichonymphagrassiiandHolomastigotoidesmirabileofCoptotermestermites[J].CellularandMolecularLifeSciencesCMLS,2002,59(11):19831992.NakashimaK,WatanabeH,AzumaJI.CellulasegenesfromtheparabasaliansymbiontPseudotrichonymphagrassiiinthehindgutofthewood-feedingtermiteCoptotermesformosanus[J].CellularandMolecularLifeSciencesCMLS,2002,59(9):15541560.杜蕾蕾.黑胸散白蚁(ReticulitermeschineseSnyder)肠道纤维素酶GHF7基因的克隆与分析[D].武汉：华中师范大学,2008.TodakaN,InoueT,SaitaK,etal.Phylogeneticanalysisofcellulolyticenzymegenesfromrepresentativelineagesoftermitesandarelatedcockroach[J].PloSone,2010,5(1):8636.AzumaJ,KanaiK,MurshimaK,etal.<Original>StudiesonDigestiveSystemofTermitesIII.:DigestibilityofXylanbyTermiteReticulitermessperatus(Kolbe)[J].Woodresearch:bulletinoftheWoodResearchInstituteKyotoUniversity,1993,79:41-51.SmithJA,KoehlerPG.ChangesinReticulitermesflavipes(Isoptera:Rhinotermitidae)gutxylanolyticactivitiesinresponsetodietaryxylancontent[J].AnnalsoftheEntomologicalSocietyofAmerica,2007,100(4):568-573.ArakawaG,WatanabeH,YamasakiH,etal.Purificationandmolecularcloningofxylanasesfromthewood-feedingtermite,CoptotermesformosanusShiraki[J].Biosciencebiotechnologyandbiochemistry,2009,73(3):710-718.NiJ,TokudaG.Lignocellulose-degradingenzymesfromtermitesandtheirsymbioticmicrobiota[J].Biotechnologyadvances,2013,31(6):838-850.MatteottiC,BauwensJ,BrasseurC,etal.IdentificationandcharacterizationofanewxylanasefromGram-positivebacteriaisolatedfromtermitegut(Reticulitermessantonensis)[J].Proteinexpressionandpurification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