当归补血汤对动脉粥样硬化内皮祖细胞的调控及作用机制

当归补血汤对动脉粥样硬化内皮祖细胞的调控及作用机制1研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是一种动脉的退行性、增生性病变,诸多危险因素造成的动脉血管内皮损伤和功能失调是As发生发展的关键；血管内皮功能及结构完整性受损将促成早期As病变形成,其中内皮细胞凋亡导致的内皮功能异常是As形成最重要的一步；内皮细胞可通过增殖、迁移、分化来修复受损血管内皮,但内皮细胞属于终末分化的细胞,其增殖能力有限,因此内皮修复需要其他来源的细胞。内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)是具有分化为血管内皮细胞潜能的干细胞,以骨髓含量居多；在生理或病理因素刺激下,损伤内皮组织释放的血管内皮生长因子(VEGF)和基质细胞衍生因子-1(SDF-1)等可促使骨髓EPCs动员至外周血,迁移、归巢于受损内皮,分化为内皮细胞,发挥内皮修复作用；然而EPCs的数量和功能在As及其相关疾病中均受到明显损害,血液中EPCs数量的减少可作为As危险性的一个标志；EPCs在维护内皮稳态中具有重要作用,其数量维持在高水平将渐弱多重危险因素的致As作用。中医学认为As属于本虚标实之病,本虚多责之于气血亏虚,标实多与痰瘀相关；近年来诸多研究表明某些益气补血、活血祛瘀的中药及其组方能通过影响EPCs的数量和功能达到抗As的作用。当归补血汤由黄芪5份及当归1份组成,具有益气补血、祛瘀生新的功能；现代药理学研究表明黄芪、当归及当归补血汤具有调血脂、抗氧化、抗炎等血管内皮保护作用；我们前期研究也表明当归补血汤可通过p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)及核因子κB(NF-κB)这两条信号通路来调控相关细胞因子的表达,减轻内皮炎症反应；p38MAPK及NF-κB信号通路是As内皮炎症损伤的重要信号转导通路,而EPCs在血管内皮炎症损伤的修复中起到非常重要的作用；当归补血汤通过“益气补血、祛瘀生新”达到抗As的作用可能与促进EPCs的数量及功能具有密切联系。2研究目的EPCs是能分化为内皮细胞的干细胞,具有修复As受损血管内皮的作用；本研究是在课题组前期研究及其他相关研究证实当归补血汤能调节血脂、抗氧化损伤、促进内皮细胞生长、保护血管内皮功能的基础上,通过研究当归补血汤对动脉粥样硬化EPCs数量及功能的作用,探讨当归补血汤对EPCs的作用效果、分子机制及信号通路,补充并发展当归补血汤防治As的作用机制,开拓中西医结合防治As研究的新思路。3研究内容3.1观察当归补血汤对As模型兔外周血及骨髓EPCs数量和功能、血清VEGF和SDF-1含量的影响,探讨当归补血汤对EPCs的整体作用效果及可能机制。3.2观察当归补血汤对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)体外刺激人外周血EPCs功能、凋亡、Bcl-2mRNA及其蛋白表达的影响,探讨当归补血汤对ox-LDL诱导EPCs凋亡的作用及机制。3.3观察当归补血汤含药血清对人外周血EPCs功能、一氧化氮(NO)分泌量、一氧化氮合成酶(eNOS)mRNA和蛋白激酶B(Akt)表达的影响,探讨当归补血汤对EPCs作用的信号转导通路。4研究方法4.1当归补血汤对As模型兔EPCs的影响及作用机制取黄芪5份及当归1份,文火水煎并浓缩成含1g/mL生药的煎液；新西兰兔25只,免疫损伤联合高脂饮食法4周后形成As模型；模型动物按体重随机分为5组,每组5只。模型组灌胃等量蒸馏水,辛伐他汀组灌胃辛伐他汀水悬液1.7mg/kg,当归补血汤高、中、低剂量组分别灌胃当归补血汤6g/kg、3g/kg、1.5g/kg,各组每日灌胃1次,持续2周,灌胃结束后采取兔腹主动脉血,Elisa法检测兔血清VEGF及SDF-1的含量；抽取髂棘及胫骨骨髓,密度梯度离心法分离获取兔外周血及骨髓单个核细胞,诱导培养EPCs,培养第7d后,将贴壁细胞与Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)和FITC标记的荆豆凝集素1(FITC-UEA-1)共同孵育以鉴定EPCs；观察细胞集落形成状况,MTT法检测细胞增殖功能,黏附实验检测细胞黏附功能,transwell小室检测细胞迁移功能,体外成血管试剂盒检测细胞成小管功能。4.2当归补血汤对ox-LDL体外刺激人EPCs的影响及作用机制取黄芪5份及当归1份,文火水煎并浓缩成含0.48g/mL生药的煎液,过滤除菌后调整药液PH值为7.2；密度梯度离心法分离获取人外周血单个核细胞,诱导培养7d后收集贴壁细胞行EPCs鉴定。将EPCs分为11组：A对照组用含0.2%牛血清白蛋白的M199培养液孵育48h；B药物处理组(共5组)分别用含蒸馏水、辛伐他汀(0.1umol/L)、当归补血汤高浓度(4g／L)、中浓度(2g／L)、低浓度(1g／L)的M199培养液孵育24h,然后移去上清,加入M199培养液继续孵育24h;Cox-LDL刺激组(共5组)分别用含蒸馏水、辛伐他汀(0.1umol/L)、当归补血汤高、中、低浓度的M199培养液孵育24h后,移去上清,加入含10mg/Lox-LDL的M199培养液继续孵育24h。处理完毕后,MTT法检测细胞增殖功能,黏附实验检测细胞黏附功能,transwell小室检测细胞迁移功能,体外成血管试剂盒检测细胞成小管功能,流式细胞仪检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR法检测Bcl-2mRNA的相对表达量,Western-blot方法检测Bcl-2蛋白的相对表达量。4.3当归补血汤含药血清对人EPCs的影响及作用机制健康新西兰大白兔8只,按体重随机分为对照组(灌胃等量蒸馏水)、当归补血汤高剂量组(15g/kg)、中剂量组(7.5g/kg)、低剂量组(1.5g/kg),每组2只,每天分两次灌胃,连续3d后禁食12h,于第4d上午灌胃2h后采取腹主动脉血,离心取上清,微孔滤器过滤除菌。分离培养并鉴定人外周血EPCs,将培养第7d的EPCs随机分为8组：A对照组加入含10%对照组兔血清的M199培养液；B辛伐他汀组加入含0.1umol/L辛伐他汀及10%对照组兔血清的M199培养液；C当归补血汤各剂量组(共3组)分别加入含10%当归补血汤高、中、低剂量含药血清的M199培养液；D当归补血汤各抑制剂组(共3组)分别加入含10%高、中、低剂量当归补血汤含药血清和PI3K/Akt特异性抑制剂wortamannin(WT)的M199培养液,以上各组处理24h后,检测细胞N0分泌量,MTT法检测细胞增殖功能,黏附实验检测细胞黏附功能,transwell小室检测细胞迁移功能,体外成血管试剂盒检测细胞成小管功能,实时荧光定量PCR法检测eNOSmRNA的相对表达量,Western-blot方法检测总Akt、磷酸化(p-Akt)的相对表达量。5研究结果5.1当归补血汤可促进As模型兔EPCs的数量及功能As模型兔外周血EPCs及骨髓EPCs的增殖功能、黏附功能、迁移功能及成小管功能均有不同程度的降低；细胞集落数可直观反应细胞的数量,培养过程中模型组家兔外周血EPCs无集落形成,而骨髓EPCs集落形成稀少,这表明EPCs的数量及各项功能均在As病变中受到损害,而当归补血汤及辛伐他汀可促进EPCs的功能及集落形成；VEGF和SDF-1是EPCs从骨髓动员至外周血,迁移分化为血管内皮过程中的关键调节因子,当归补血汤及辛伐他汀组动物血清VEGF、SDF-1较模型组维持在较高水平,这提示当归补血汤可能是通过维持循环VEGF、SDF-1的水平来参与调节促进EPCs的数量及功能。5.2当归补血汤可保护。x-LDL体外诱导EPCs的凋亡及功能辛伐他汀及当归补血汤高、中、低浓度均能显著改善正常人EPCs的增殖功能、迁移功能、黏附功能及成小管功能；EPCs各项功能在ox-LDL刺激后均受到不同程度的损害,细胞凋亡严重,Bcl-2mRNA及蛋白的表达下降；加入当归补血汤干预后,EPCs的各项功能得到了一定程度的恢复,细胞存活增加,Bcl-2mRNA及蛋白的表达上调；这提示当归补血汤是通过上调细胞Bcl-2mRNA及蛋白的水平来促进EPCs活性,保护ox-LDL诱导后受损的EPCs功能,抑制细胞凋亡,发挥保护效应。5.3当归补血汤可通过PI3K/Akt通路调控EPCs的活性当归补血汤含药血清及辛伐他汀均可促进EPCs增殖功能、迁移功能、黏附功能及成小管功能,促进细胞N0的分泌,上调eNOSmRNA及总Akt、p-Akt蛋白的表达;特异性抑制剂WT能阻断当归补血汤含药血清对EPCs各项功能的促进作用,而且经当归补血汤含药血清处理的细胞分泌NO、表达eNOSmRNA及总Akt、p-Akt蛋白的水平均在WT处理后明显渐弱,这证明当归补血汤调控EPCs活性的可能机制之一是通过PI3K/Akt信号通路。6讨论及结论As及其相关疾病,中医研究认为其病机主要是气血不足、血脉瘀阻；动脉粥样硬化EPCs数量及功能的受损与气血不足、血脉瘀阻有着密切的关系；EPCs具有干细胞功能,能通过动员、归巢、分化等步骤修复受损的内皮细胞,可被认为是中医学的“正气”：中医认为“正气存内,邪不可干”,补益正气能提高机体功能,促进修复,因此可将EPCs对As损伤内皮的修复理解为机体正气抗邪、驱邪外出、固卫自身的表现。当归补血汤通过益气补血,祛瘀生新达到抗As作用与促进EPCs活性之间具有密切联系。本文在国内率先开展了当归补血汤对动脉粥样硬化EPCs调控作用的研究,结果表明EPCs的数量及功能在As病程中受到不同程度的损害,当归补血汤可通过PI3K/Akt信号通路调控动脉粥样硬化EPCs的数量和功能,动员并促进其迁移、归巢、粘附