激光共聚焦扫描显微镜

激光共聚焦扫描显微镜随着计算机技术和光电技术的飞跃发展，八十年代后期开始实际应用的激光共聚焦扫描显微镜（LSM）,使人们在医学生物学上对活细胞的动态观察、细胞无损伤探测、免疫荧光标记和离子荧光探针的观察和研究上有了更加得心应手的手段和工具。随着计算机、光学显微镜、大数值孔径复消色差物镜、高分辨率分析显示、激光源、激光功率、高敏感度探测器、声光转换电子控制和各种荧光标记物的发展，使得LSM向更精、更快、多维和无损伤性分析的方向发展。概念：激光共聚焦扫描显微镜就是激光源加共聚焦显微镜，具体说就是利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察分析对象进行数字图象处理的一套观察和分析系统。LSCM的主要组成部分及工作原理:f的Iphut贯(rVTILSCM的主要组成部分及工作原理:f的Iphut贯(rVTI<s+>FFM4i>riii■■LIq站常沖匕pinhok-•乂Jt片斗畀4■■卄札fctfrAw.kDt*|illuminatingpinhole:照明针孔功能:使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与detectorpinhole（探测器针孔）及焦平面形成共聚焦装置。beamsplitter：光束分离器功能：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。Objective:物镜功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。该光斑经过objective,beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminatingpinhole及detectorpinhole两处聚焦。共聚焦的含义由此而来。detectorpinhole:探测器针孔功能：与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息(两点共轭)。PMT：光电倍增管(探测器)功能：接受通过针孔的光信号，转变为电信号传输至计算机，在屏幕上出现清晰的整幅焦平面的图象。激光器：图中未示。共聚焦显微镜技术的发展离不开激光器的飞速发展。我们可以根据研究需要选择不同的激光器。如ArUV(351.364nm),HeCd(442nm),AR(457,488,514nm),ArKr(488,568,647nm)Kr(568nm),HeNe(543nm),HeNe(633nm)等。多荧光通道：具有多个荧光通道，以实现同时对样品进行多种标记。经过对LSCM的各组成部分了解之后，其工作原理不难理解。即：点光源照射样品产生的激发光斑被探测器以共扼的形式接收于焦平面，计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上。为产生一幅完整图象，可通过计算机控制的步动电动机带动显微镜移动，以实现在同一焦平面上的逐点扫描。同样，也可以通过沿Z轴方向逐渐改变焦平面，来完成对样品不同层面的扫描。亦即可对细胞或组织厚片进行类似CT断层扫描的无损伤连续光学切片，连续光学切片经过计算机三维重建的处理，能够从任意角度观察标本的三维剖面或整体结构

LSCM相对光学显微镜的优点:（1）:LSCM的图象是以电信号的形式记录下来的，所以可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图象处理:（2）LSCM利用共聚焦系统有效的排除了焦点以外的光信号干扰，提高了分辨率，显著改善了视野的广度和深度，使无损伤的光学切片成为可能，达到了三维空间定位；（3）由于LSCM能随时采集和记录检测信号，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径：（4）LSCMLSCM相对光学显微镜的优点:主要技术指标:1）：xy分辨率：Rxy=0.4波长/数值孔径，是传统显微镜Rxy（0.61波长/数值孔径）的1.4倍，但比起透射电子显微镜0.1nm的分辨率仍低很多，它是连接这两种常规技术的中间桥梁（）。2） ：待测样品最大厚度：约1-2mm.3） ：样品最小光切厚度：40nm4） ：Z轴最大分辨率：0.35um.5） ：扫描速度:slow:单向:2201ines/s512x5122-3秒双向：4401ines/smediumm：单向：450lines/s512x5121.7秒双向：900lines/sfast:单向：1000lines/s512x5120.7秒双向：2000lines/sCLSM在医学生物学上的应用:激光共聚焦显微镜适用于细胞生物学、细胞生理学、神经生物学和神经生理学等几乎所有涉及细胞研究的医学和生物研究领域。（一）在医学生物学上应用的最大特点是对活细胞进行无损伤性的实时观察分析。能观察各种染色，非染色、荧光标记的组织（包括活组织）、培养细胞、粘附细胞、细胞涂片、石蜡切片和冰冻切片等。能对活细胞，组织进行形态和功能相结合的研究，包括细胞、组织结构的精确描绘、定位（二维和三维甚至多维）和上述结构的动态变化，进行准确的定性、定量、定时和定位分布观察，细胞生物物质、离子的准确定性、定量、定时和定位分布检测，细胞离子通道的直观观察和变化的动态描绘，细胞在生理和病理及药理情况下对外界因素（细胞处理和药物的作用等）产生快速反应的实时记录等。对活细胞和组织或细胞组织切片进行连续断层扫描，能获得精细的单个细胞或群细胞或所观察的局部组织的各个层面结构（包括细胞特异结构－如细胞骨架、色体、细胞器和细胞膜系统，样品的深层结构）和完整的3D图像；细胞内离子荧光标记，单标记、双标记或三标记，甚更高多重标记，检测细胞如pH和钠、钾、钙、镁等离子浓度的比率测定及其动态变化；荧光标记探针标记的活细胞或切片标本的细胞生物物质，膜标记、细胞示踪、疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多物质标记，同时观察；荧光检测快、激发光强度精确控制、光漂白和荧光淬灭作用小；对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图象可及时输出或期储存。（二）具体可应用于下列领域：1.细胞生物学：细胞结构，细胞骨架，细胞膜结构、流动性、受体，细胞器结构和分布变化，细胞凋亡；2•生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析；3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学；4•生理学：膜受体，离子通道，细胞内离子含量、分布、动态分析；5•遗传学和胚胎学：细胞生长、分化、成熟变化，细胞组织的三维结构甚至再多的结构，染色体分析，基因表达，基因诊断；神经生物学：神经细胞结构，神经递质的成分、运输和传递，递质受体，离子外流，神经组织（如大脑皮质）结构、细胞分布；微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构（表面和内部结构）；病理学及病理学临床应用：活检标本的快速诊断，肿瘤诊断，自身免疫性疾病诊断，HIV,宫颈上皮细胞涂片诊断；生物学，免疫学，环境医学和营养学；样品制备及其处理要求：•样品制备无特殊要求；•各种染色，非染色、荧光标记的组织（包括活组织）、培养细胞、粘附细胞、细涂片、石蜡切片、冰冻切片。使用方法：例如：用激光扫描共聚焦显微镜观察大鼠海马CA3区锥体细胞核酸的变化先制备脑片。用激光扫描共聚焦显微镜获取连续共聚焦图像将染色后的脑片用混合气饱和的ACSF冲洗3遍，静置片刻使其贴附于培养皿底，保持湿润状态。在继续通以混合气条件下，将样品放在激光扫描共聚焦显微镜的载物台上，在倒置显微镜下寻找待重