生物化学中蛋白质

蛋白质的结构与功能第一章StructureandFunctionofProtein一、什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。二、蛋白质的生物学重要性1.蛋白质是生物体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个局部都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。1〕.催化蛋白质的一个最重要的生物学功能是作为有机体新陈代谢的催化剂——酶。酶是蛋白质中最大的一类。2〕、调节许多蛋白质具有调节其他蛋白质执行其生理功能的能力，这些蛋白质称为调节蛋白3〕、转运功能是从一地到另一地转运特定的物质。4〕、贮存这类蛋白质是氨基酸的聚合物，生物体必要时可利用蛋白质作为提供充足氮素的一种方式。蛋白质的功能

5〕、运动作为运动根底的收缩和游动蛋白具有共同的性质：它们都是丝状分子或丝状聚合体。6〕、结构成分蛋白质另一重要功能是建造和维持生物体的结构。7〕、防御和进攻免疫反响〔免疫球蛋白〕8〕、异常功能蛋白质的分子组成

TheMolecularComponentofProtein第一节

组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘

。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量,这是凯氏定氮法测定蛋白质含量的计算根底。100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%

蛋白质元素组成的特点6.25—16％的倒数，每测定１g氮相当于6.25g的蛋白质。也就是1g氮所代表的蛋白质量〔克数〕蛋白质含量＝蛋白氮×6.25一、氨基酸

——组成蛋白质的根本单位存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸〔甘氨酸除外〕。酪氨酸H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R非极性疏水性氨基酸(非极性R基氨基酸)极性中性氨基酸(不带电荷的极性R基氨基酸)酸性氨基酸〔含有两个羧基〕碱性氨基酸〔含有两个以上氨基〕〔一〕氨基酸的分类〔按其侧链®的结构和理化性质分类〕*20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00缬氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucineLeuL

5.98异亮氨酸

isoleucineIleI

6.02苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30非极性疏水性氨基酸天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22赖氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginineArgR

10.76组氨酸

histidineHisH

7.593.酸性氨基酸4.碱性氨基酸几种特殊氨基酸脯氨酸〔亚氨基酸〕

半胱氨酸+胱氨酸二硫键-HH〔二〕氨基酸的理化性质1.两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。等电点(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性离子阳离子阴离子带电状态判定：等电点〔pI〕pH>pIaa“-〞aa向正极移动pH<pIaa“+〞aa向负极移动pH=pIaa“0〞aa不移动中性氨基酸：pK1，为α—羧基的解离常数，pK2，为α—氨基的解离常数。pI=(pK1，+pK2，)/2酸性氨基酸：pK1，为α—羧基的解离常数，pK2，为侧链羧基的解离常数。

pI=(pK1，+pK2，)/2碱性氨基酸：pK2，为α—氨基的解离常数，pK3，为侧链氨基的解离常数。pI=(pK2，+pK3，)/2等电点计算2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm

附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收3.茚三酮反响氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。二、肽*肽键(peptidebond)是由一个氨基酸的

-羧基与另一个氨基酸的

-氨基脱水缩合而形成的化学键。〔一〕肽(peptide)+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键*肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合那么形成三肽……*肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有两端*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。N末端C末端牛核糖核酸酶〔二〕几种生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSGGSH复原酶NADPH+H+NADP+

体内许多激素属寡肽或多肽神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽三、蛋白质的分类*根据蛋白质组成成分单纯蛋白质－－单纯蛋白不含有非蛋白质部分。这类蛋白质水解后的最终产物只有氨基酸。结合蛋白质=蛋白质部分+非蛋白质部分*根据蛋白质形状纤维状蛋白质－－分子很不对称，形状类似纤维。球状蛋白质－－分子的形状接近球形，空间构象比纤维状蛋白复杂。蛋白质的分子结构

TheMolecularStructureofProtein

第二节蛋白质的分子结构包括

一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)高级结构定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序，主要靠肽键维系。一、蛋白质的一级结构主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。肽键(peptidebond)：一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基缩水而成的酰胺键称为肽键。〔…CONH…〕一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的根底。目录二、蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象

。也就是该肽段主链骨架原子的相对空间位置，主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲。维持二级结构的力量为氢键。定义

主要的化学键：

氢键

肽单元肽平面(peptideunit，肽单元)：由肽键中的四个原子和与之相邻的两个碳原子共同构成的刚性平面。〔CαCONHCα〕蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折叠(

-pleatedsheet)

-转角(

-turn)

无规卷曲(randomcoil)

特征：1、每隔3.6个AA残基螺旋上升一圈，螺距0.54nm;2、螺旋体中所有氨基酸残基R侧链都伸向外侧，链中的全部>C=0和>N-H几乎都平行于螺旋轴;3、每个氨基酸残基的>N-H与前面第四个氨基酸残基的>C=0形成氢键，肽链上所有的肽键都参与氢键的形成。α－螺旋〔α－helix〕形成因素：与ＡＡ组成和排列顺序直接相关。多态性：多数为右手〔较稳定〕，亦有少数左手螺旋存在〔不稳定〕；存在尺寸不同的螺旋。β－折叠〔β-pleatedsheet〕

特征：两条或多条伸展的多肽链〔或一条多肽链的假设干肽段〕侧向集聚，通过相邻肽链主链上的N-H与C=O之间有规那么的氢键，形成锯齿状片层结构，即β－折叠片。类别：平行反平行-折叠-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。①在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm.②-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同局部之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。③-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。β－转角〔β-turn〕

特征：多肽链中氨基酸残基n的羰基上的氧与残基〔n+3〕的氮原上的氢之间形成氢键，肽键回折1800。无规那么卷曲示意图无规那么卷曲细胞色素C的三级结构蛋白质分子中那些没有确定规律性的局部肽链构象称为无规卷曲。蛋白质的超二级结构和结构域

(2)结构域〔structuredomain〕蛋白质中相邻的二级结构单位〔即单个α－螺旋或β－折叠或β－转角〕组合在一起，形成有规那么的、在空间上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构★超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域．根本组合方式：αα；β×β；βββ在二级结构的根底上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体称为结构域。结构域具有独特的空间构象，与分子整体以共价键相连，并承担特定的生物学功能。形成意义：动力学上更为合理蛋白质〔酶〕活性部位往往位于结构域之间，使其更具柔性(１)超二级结构〔supersecondarystructure〕超二级结构类型βββααβ×β12345

52341

Β-链βαββ-迂回回形拓扑结构回形拓扑结构β-迂回卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域-螺旋-转角-折叠二硫键结构域1结构域2氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为根底的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或β-折叠，它就会出现相应的二级结构。三、蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和VanderWaals力等。主要的化学键整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置，包括主链和侧链。三级结构的形成使得在序列中相隔较远的氨基酸侧链相互靠近。〔一〕定义目录肌红蛋白(Mb)的三级结构N端C端亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。四、蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。血红蛋白的四级结构

蛋白质的结构层次

一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→亚基→四级结构一级结构

二级结构三级结构四级结构维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键a盐键〔离子键〕b氢键c疏水相互作用力d范德华力e二硫键f酯键氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级结构特别重要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定离子键氢键范德华力疏水相互作用力蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三节〔一〕一级结构是空间构象的根底一、蛋白质一级结构与功能的关系牛核糖核酸酶的一级结构二硫键天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性牛核糖核酸酶〔二〕一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病〞。分子病在蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基，即使在整个分子中发生一个残基的异常，该蛋白质的功能也会受到明显的影响。（一）肌红蛋白(Mb)与血红蛋白(Hb)结构二、蛋白质空间结构与功能的关系Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数〔称百分饱和度〕随O2浓度变化而改变。〔二〕血红蛋白的构象变化与结合氧肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线*协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用那么称为正协同效应(positivecooperativity)如果是抑制作用那么称为负协同效应(negativecooperativity)O2血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。变构效应(allostericeffect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。〔三〕蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象疾病：假设蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病第四节蛋白质的理化性质与别离纯化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein〔一〕蛋白质的两性电离一、理化性质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。〔二〕蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素颗粒外表电荷水化膜+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉〔三〕蛋白质的变性、沉淀和凝固*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。

变性的本质——破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂〔如疫苗等〕的必要条件。假设蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或局部恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较巩固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。(不可逆过程)〔四〕蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。〔五〕蛋白质的呈色反响⒈茚三酮反响(ninhydrinreaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反响。⒉双缩脲反响(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反响称为双缩脲反响，双缩脲反响可用来检测蛋白质水解程度。二、蛋白质的别离和纯化〔一〕透析及超滤法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。*超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，到达浓缩蛋白质溶液的目的。利用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对混合物溶液进行别离、分级、提纯和富集的方法。反渗透、超滤、微滤、电渗析及传统的透析法均为膜别离技术。原理：大分子不能透过膜而被截留，小分子能透过膜，使分子大小不同的物质得到别离。

技术关键：根据欲别离成分的具体情况选用规格适宜的过滤膜。

不同膜过滤被截留的分子大小有区别。如运用超滤，选用适当规格的膜可实现对中药提取液中多糖类、多肽类、蛋白质类的截留别离。〔二〕丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀*使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即别离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等参加蛋白质溶液，使蛋白质外表电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。等电点pI=5pH=6环境-pH=4+环境--++000凝聚*盐析疏水性物质间的亲和力：水笼

Clathrate●

水分子会包围在非极性分子四周，形成类似竹笼的结构，隔离非极性分子，水分子本身的流动性因此而降低。*免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中别离获得抗原蛋白。■各种盐析及沉淀法的比较

Saltingin盐溶Saltingout盐析有机溶剂沉淀蛋白质分子表面的帶电基团蛋白质分子表面的非极性基团除了hydrophobic

之外的其他作用力NaCl(单价离子)硫酸铵(两价离子)甲醇、丙酮等蛋白质在其pI下，因净电荷为零而聚集沉淀；假设参加盐类，阻碍其聚集而增加溶解度。两价离子在溶液中抢走附在蛋白质表面(非极性部分)的水分子，使非极性部分相互吸引聚集沉淀。降低水活性，溶液的介电常数下降，增加蛋白质溶质分子之间的作用力，而聚集在一起。影响因素试剂机制其它说明对较低浓度缓冲液透析是saltingin的反向过程。1)非极性蛋白质较早沉淀。2)在硫酸铵中蛋白质相当稳定。1)局部蛋白质变性。2)有助沉淀的因素：蛋白质分子量大、缓冲液pH靠近pI。3)脂溶性蛋白质的溶解度反而增加〔三〕电泳蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而到达别离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而别离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶