大豆Gmubi和马铃薯Patatin2启动子在芥菜中的表达分析

大豆Gmubi和马铃薯Patatin2启动子在芥菜中的表达分析植物基因工程技术作为一种改良品种性状的辅助手段,能够加快选育的进程。在植物基因工程的研究中,除了优良基因的分离与克隆外,调控外源基因的表达的启动子也是重要研究的研究课题。启动子能够在转录水平上参与调控下游基因表达,从而得到能够抵御外界环境的胁迫、抗逆性增强和营养价值更高的植物新品种。植物基因工程中,往往需要目的基因在受体植物中大量高效表达。目前,在转基因植物研究中,大多数使用组成型启动子如花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子和从木薯叶脉花叶病毒中分离的CsVMV启动子。然而,在利用基因工程对植物进行改良的过程中,有时需要同时引入多个基因实现对某特定性状的控制,这无疑将使用到多个启动子。因此,人们需要去寻找更多有效的组成型启动子,实现植物复杂性状的人工调控。另外,为实现外源基因在特定的部位或器官中表达,需要大量用到组织特异性启动子或器官特异性启动子。该类启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累,增加区域表达量,同时也可以避免过度的消耗细胞内的物质与能量而对植物自身的生长发育带来不良的影响。针对上述情况,本论文将从植物大豆中克隆得到的Gmubi组成型启动子,从马铃薯中克隆得到Patatin2特异性启动子,与GUS基因融合分别构建以Bar基因(对除草剂Basta具有抗性)为筛选标记的植物表达载体pCABarGmubiGus和pCABarPatatin2Gus,通过农杆菌介导法导入渝丰芥菜,研究两个启动子在异源生物中的表达特性,为今后利用上述启动子在植物中进行基因功能分析以及转基因植物的开发奠定基础。具体获得的结果如下：1.Gmubi启动子的克隆及功能分析载体构建根据NCBI数据库中已经公布的大豆polyubiquitin(ubi)基因启动子序列(EU310508.1),设计引物从大豆DNA中扩增到大小约0.9kb片段,克隆到pBluescript载体上进行测序验证。序列分析显示扩增到的序列长度为917bp,与EU310508.1目标序列有7个核苷酸不一致,序列一致性为99%。用HindⅢ+Ncol酶切下917bp的Gmubi替换载体PCABarGus中的35S启动子,获得表达载体PCABarGmubiGus。2.Patatin2启动子的克隆及功能分析载体构建根据NCBI数据库中已经公布的马铃薯PatatinClassII启动子序列(X60398.1),设计引物从马铃薯DNA中扩增到大小约0.7kb片段,克隆到pBluescript载体上进行测序验证。序列分析显示扩增到的序列长度为669bp,与X60398.1目标序列有4个核苷酸不一致,序列一致性为99%。用HindIII+NcoI酶切下677bp的Patatin2替换载体PCABarGus中的35S启动子,获得表达载体PCABarPatatin2Gus。3.农杆菌介导法获得转基因芥菜植株利用农杆菌介导法,将构建的两个植物表达载体pCABarGmubiGus、pCABarPatatin2Gus和阳性对照pCABar35SGus用农杆菌介导转化“渝丰”榨菜下胚轴,通过PPT(phosphinothricin,膦丝菌素)的多轮筛选获得转基因芥菜植株。4.转基因芥菜植株的分子检测提取转基因植株DNA用相应的引物进行PCR扩增。用Gmubi启动子引物从10株pCABarGmubiGus除草剂抗性植株中检测到6株抗性植株含有Gmubi启动子序列。用HPatatin2启动子引物从10株pCABarPatatin2Gus除草剂抗性植株中检测到5株抗性植株含有Patatin2启动子序列。5.pCABarGmubiGus、pCABarPatatin2Gus转基因植株GUS组织化学分析pCABar35SGus对照转基因芥菜植株叶、茎、花、种子、根均具有很强的GUS活性,而非转基因野生型芥菜叶、茎、花、种子、根均无GUS活性。pCABarGmubiGus转基因芥菜植株的叶、茎、花、种子、根均具有很强的GUS活性,表明Gmubi启动子能够在芥菜中组成型表达。然而,对获得的所有pCABarPat