丙泊酚对人脑血管平滑肌细胞低氧再复氧损伤的保护和机制研究

丙泊酚对人脑血管平滑肌细胞低氧再复氧损伤的保护和机制研究【研究背景】随着神经生理学、神经药理学、现代诊断学及神经外科手术技术的进步,神经外科手术越来越广泛的应用到了癫痫、脑肿瘤、脑卒中等疾病的治疗。然而,近年的研究也发现了神经外科手术会产生诸如脑血管痉挛、心功能障碍、电解质紊乱以及术后脑部缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusioninjury,IRI）等并发症。因此,如何避免术后损伤和并发症,提高患者术后生存质量日益受到关注。同时也对神经外科的麻醉工作提出了更加严峻的要求:首先,根据手术类型制订更加合理的麻醉方案,最大程度地配合手术操作;其次,合理有效地将脑保护基础研究应用于临床,改善术后患者生存质量。大量研究表明,麻醉药物具有细胞保护作用。因此更好地认识其作用机制,可为临床提供更多的改善预后的策略。丙泊酚是目前临床上普遍用于麻醉诱导、麻醉维持、ICU危重患者患者镇静的一种快速、短效的静脉麻醉药。它具有麻醉诱导起效快、苏醒迅速且功能恢复完善、术后恶心呕吐发生率低等优点。近年的研究还发现丙泊酚在产生广泛中枢抑制作用的同时,还具有降低脑耗氧量、降低颅内压（intracranialpressure,ICP）和抗惊厥、抗炎症、抗氧化以及支气管舒张等特性,能够减轻神经外科手术术后脑组织和血管损伤。然而,丙泊酚对于脑血管缺氧损伤的具体保护机制尚未十分明确。平滑肌细胞广泛分布于人体消化道、呼吸道、血管和泌尿生殖等系统。在功能上通过缩短和产生张力使器官发生运动和变形,也可产生持续或紧张性收缩,使器官对抗所加负荷而保持一定的形态,前者如胃和肠道,后者如动脉血管、括约肌等。血管平滑肌细胞是血管中膜的主要成分,它不仅是维持血管壁结构完整性的物质基础,也在血管收缩、调节血管张力和血压以及血流分布等生理功能方面发挥重要作用,是血管性疾病病变的主要细胞成分之一,在疾病的发生、发展中起重要作用。血液需要依赖血管为载体输送到组织。在缺血性疾病的再灌注过程中,如何维持正常的血管功能也是面临的关键课题之一。目前大量学者着眼于研究脑缺血再灌注损伤对神经元细胞、血管内皮细胞的影响,并探讨了其可能机制,对人脑血管平滑肌细胞（humanbrainvascularsmoothmusclecells,HBVSMC）的研究鲜有报道。目前HBVSMC细胞的离体培养是血管研究中的重要模型,为血管疾病的药理学和治疗研究提供大量信息。【研究目的】本研究以离体培养HBVSMC细胞为研究对象,建立离体HBVSMC细胞低氧再复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）模型模拟缺血再灌注,观察丙泊酚对HBVSMC细胞H/R后的细胞活性和细胞凋亡的影响,研究H/R对HBVSMC细胞的损伤及丙泊酚的保护作用。同时进一步检测相关蛋白表达,初步探讨H/R对HBVSMC细胞的损伤及丙泊酚的保护作用的可能机制。本研究有助于阐明H/R对HBVSMC细胞的损伤作用,证实丙泊酚对HBVSMC细胞H/R损伤的保护作用,为进一步防治缺血再灌注损伤提供新的理论依据。【研究方法】本研究分为以下三部分:第一部分:建立人脑血管平滑肌细胞H/R损伤模型细胞培养:HBVSMC细胞购自中国科学院细胞库（上海,中国）。细胞培养在含10%GIBCO胎牛血清的DMEM培养液中,并添加1%青霉素和链霉素。细胞培养在37℃的湿润环境中,气体环境为5%的二氧化碳和95%的空气构成的混合气体。通过三气培养箱和低氧/厌氧工作站控制环境氧气浓度,将细胞于低氧条件（0.5%O₂、5%CO₂和94.5%N₂）下分别暴露2h、4h、6h、8h、10h。低氧后,细胞再恢复到常氧条件（5%CO₂和95%空气）下培养16h。利用CCK-8检测细胞的生存活性,采用ELISA法测定细胞上清液SOD、LDH和MDA水平。第二部分:观察不同浓度的丙泊酚对人脑血管平滑肌细胞H/R损伤的作用H/R后HBVSMC细胞活力抑制率为40%左右的低氧再复氧条件为HBVSMC细胞最佳H/R条件。根据第一部分研究结果显示,最后确定低氧条件（0.5%O₂、5%CO₂和94.5%N₂）下暴露8h为实验所需低氧条件。将丙泊酚在低氧前加入丙泊酚组细胞培养液中,使终浓度达到25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L三种不同浓度。将细胞于低氧条件（0.5%O₂、5%CO₂和94.5%N₂）下暴露8h。低氧后将细胞恢复到常氧条件（再氧化）再培养16h。利用CCK-8检测各组细胞的生存活性,采用ELISA法测定细胞上清液SOD、LDH和MDA水平;通过流式细胞技术检测细胞凋亡;利用Westernblot方法测定细胞的Bax、Bcl-2、Caspase3、Sur2b、Kir6.1、JNK、p-JNK、mTOR和p-mTOR蛋白表达水平。第三部分:探讨丙泊酚对人脑血管平滑肌细胞H/R损伤保护作用的机制第二部分研究发现,50μmol/L浓度的丙泊酚的细胞保护作用最佳,所以我们采用50μmol/L丙泊酚+SP600125/Everolinmus在低氧前添加入细胞培养液中。细胞在低氧条件（0.5%O₂、5%CO₂和94.5%N₂）下暴露8h。两种药物干预之后,利用CCK-8检测各组细胞的生存活性,采用ELISA法测定细胞上清液SOD、LDH和MDA水平;通过流式细胞技术检测细胞凋亡;利用Westernblot方法测定细胞的Bax、Bcl-2、Caspase3、Sur2b、Kir6.1、JNK、p-JNK、mTOR和p-mTOR蛋白表达水平。【结果】第一部分:建立人脑血管平滑肌细胞H/R损伤模型与对照组相比,各低氧组细胞在H/R后细胞活性均显着降低,且随着低氧时间延长细胞活性递减。各低氧组细胞LDH、MDA含量显著升高,SOD活性显著降低。随着低氧时间的延长,各低氧组细胞LDH、MDA含量递增,相反SOD活性递减。本研究结果显示,最后确定低氧条件下暴露8h为实验所需低氧条件。第二部分:观察不同浓度的丙泊酚对人脑血管平滑肌细胞H/R损伤的作用与模型组比较,丙泊酚处理明显抑制细胞存活率的降低。丙泊酚对H/R诱导的细胞损伤的抑制作用具有一定的剂量依赖性。100μmol/L浓度的丙泊酚处理后细胞活性略有下降。因此,50μmol/L的丙泊酚细胞保护作用最佳。和模型组对比,丙泊酚的预处理显著的抑制H/R引起的LDH释放,降低MDA含量,同时显著提升SOD活性。丙泊酚显著降低H/R后细胞的凋亡率。Westernblot结果显示,丙泊酚显著抑制H/R后Bax,Caspase3,Kir6.1和JNK蛋白表达的上调,同时显著抑制Bcl-2和p-mTOR蛋白表达的下调。第三部分:探讨丙泊酚对人脑血管平滑肌细胞H/R损伤保护作用的机制在细胞低氧前分别加入丙泊酚联合JNK的抑制剂SP600125或mTOR抑制剂Everolimus进行研究。与丙泊酚预处理组对比,丙泊酚+SP600125组的细胞存活率高于丙泊酚组,进一步降低细胞凋亡率,显著提高细胞活性;Bax、Caspase3、Kir6.1和p-JNK蛋白表达相对于丙泊酚组进一步显著降低,Bcl-2和p-mTOR蛋白的表达显著增加。相反地,丙泊酚+Everolimus组抑制丙泊酚对于细胞H/R损伤后的保护作用。丙泊酚+Everolimus组细胞存活率低于丙泊酚组,使细胞凋亡率升高,显著降低细胞活性;Bax、Caspase3、K