对一起聚集性发热伴血小板减少综合征的研究及该病病毒载量与病情相关性研究

对一起聚集性发热伴血小板减少综合征的研究及该病病毒载量与病情相关性研究背景发热伴血小板减少综合征(SevereFeverwithThrombocytopeniaSyndromeSFTS)是我国在2009年首次发现的新发病毒性传染病,病死率为高达30%。SFTS目前考虑是发热伴血小板减少综合征病毒(Severefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus,SFTSV)感染导致。其主要临床表现为发热、血小板减少、白细胞减少以及胃肠道症状等,少数重症患者可因多脏器损害而死亡。目前2011年至2014年全国23个省共报告SFTS5352例,其中16个省报告确诊病例2750例,以河南、湖北、山东等地高发。而且类似病例在日本、韩国和美国均有报道。部分SFTS患者发病前有蜱虫叮咬史。此外考虑SFTSV在人与人之间传染存在,从2007年至2015年,在河南、江苏、辽宁、山东、安徽、河北、浙江、以及韩国均有SFTS聚集性案例报道。目前考虑人与人之间传染的主要危险因素是直接接触患者的血液。而其他潜在的接触途径如尿、粪、呼吸道分泌物等的暴露因素在人与人之间传播的关系不大。近年来,在少数SFTSV感染的聚集性病例中有隐性感染的报道,表明人传人SFTSV感染可以是隐性感染,但应进一步研究。SFTSV具有广嗜性,可感染肝、肺、肾等多种器官。SFTS临床表现多样,可累积多个器官。多以骤然发热起病,表现为食欲不振、乏力、恶心呕吐等消化道症状、淋巴结肿大、血小板减少、白细胞减少等症状。可出现中枢神经系统症状如淡漠、嗜睡、震颤、惊厥和昏迷等,及出血表现如瘀点、瘀斑、注射部位血肿、呕血、便血、血尿和阴道出血。并可出现生化和其他实验室检查异常,如血清ALT、AST、GGT、LDH、CK、CK-MB和血糖的升高,严重病例出现多脏器功能衰竭和DIC。而SFTSV在人体内存在的时限,与病情及预后的相关性,目前报道罕见。本研究主要分出两个部分:1.对一起聚集性发热伴血小板减少综合征病例进行研究;.2.对SFTSV载量与患者的病情进行相关性研究。以进一步了解SFTS的传染机制,提高临床医师对本病的认识,以对SFTS的临床诊治和防护做出指导。第一部分对一起聚集性发热伴血小板减少病例综合征病例的研究目的1.研究可能导致发热伴血小板减少综合征(SFTS)人与人之间传染的接触方式及对其进行评估。2.对SFTS隐性感染患者的传染方式进一步研究,以对SFTS的临床诊治和防护做出指导。方法1.收集2014年7月山东省发生的一起疑似聚集性发热板血小板减少综合征的6个病例(病例A、病例B、病例C、病例D、病例E、病例F)的临床资料和样本。并对患者及其密切接触者或家属进行了居住环境、蜱虫叮咬史、动物接触史、可能暴露途径、是否采取了保护性措施等的流行病学调查。2.从病例A的血涂片的刮取物提取总RNA用于巢式RT-PCR检测。其余5例患者的血样标本采集离心后吸取血清上清液保存于-70℃直至用于提取病RNA。3.使用TRIzol提取血清中的总RNA。4.逆转录合成cDNA后,分装后保存于-80℃冰箱。5.针对SFTSV基因组的S、M、L片段分别设计两对内嵌式简并引物,进行巢式RT-PCR,扩增样本中SFTSV的S、M、L的部分片段。6.PCR产物使用琼脂糖胶电泳,用凝胶成像仪观察并回收。7.将特异性PCR片段纯化测序,测序结果经过DNAStar软件中的Seqman进行拼接,通过序列比对分析进一步确认上述病例中SFTSV感染情况。8.将确认为SFTSV阳性的血清样本接种DH82细胞,收获各代次培养上清离心弃去细胞碎片沉淀,分装至细胞冻存管至于-80℃冻存。9.取各代次细胞培养上清,提取总RNA后逆转录为cDNA,RT-PCR方法检测培养上清中病毒并分离扩增。10.PCR检测为阳性的细胞上清1ml与DH82细胞孵育,用间接免疫荧光法(IFA)检测细胞中病毒蛋白的表达。11.对分离到的病毒进行全基因序列的测定。12.使用间接免疫荧光法(IFA)和细胞ELISA(cELISA)的方法对采集的血清样本中抗SFTSV特异性IgM及IgG的水平进行检测。13.使用抗体中和实验(MNA)对血清中中和抗体进行测定。14.将纯化后的PCR阳性产物进行克隆测序。将测定的核酸序列用DNAstar软件的SeqMan进行拼接和校对;利用DNAStar软件包中的MegAlign软件进行序列比对,用Mega5.0中的最大相似度法构建进化树,对各患者或密切接触者血清样本的PCR产物片段的核酸序列和分离到病毒的基因组序列进行对比和进化分析,从遗传学的角度揭示该聚集性SFTS病例的人与人之间传染的可能。结果:1.病例A在入院第二天死于多脏器功能障碍;给于病例B支持治疗、输注血小板、皮下注射粒细胞集落刺激因子等后,治疗无效病情恶化,于发病第10天死亡;病例C给于对症支持治疗后,病情好转,于发病14天痊愈出院;密切病例D、E和F接触患者后无一发病。病例A、B、C均有发热伴血小板减少,其中病例A和病例B还伴有白细胞减少。2.病例B和病例C都直接接触了病例A的血液和皮肤黏膜并污染了衣物,病例A整个过程中和事后未采取任何保护措施,而且事后继续穿沾了血液的衣物照顾病例A,而病例C事后把他沾了血液的衣服扔了,然后洗了双手,洗了个澡。病例D接触过C,病例E接触过B,病例F均接触过B和C。病例D、E、F均接触过患者的皮肤、黏膜和体液,病例D和病例E未采取任何保护措施,而病例F带了口罩而且后来洗手了。可推断聚集性病例中SFTSV可能的传播路线是从原发患者(病例A)至继发患者(病例B和病例C),然后是从病例B至病例E和病例F,病例C至病例D和病例F。3.病例A的血涂片及病例B的血样中检测到SFTSV的RNAS片段(1160-1513nt)及L片段(589-806nt),但是在病例C的血样中未检测到上述片段。病例D的血样中未检测到SFTSV的RNA片段,但是在病例E和病例F的血样中检测到SFTSVRNA的L片段。4.通过cELISA我们可以检测到病例B、病例C、病例D、病例E及病例F的血样中有不同滴度的IgM水平;而通过IFA,我们只检测到病例E和病例F的IgM阳性。5.通过cELISA我们可以检测到病例B和病例C有低滴度的IgG;而通过IFA检测到病例B的血样IgG阳性。6.MNA显示从病例B血样中分离到的病毒可以和病例E和病例F的血样起反应,发生中和作用。7.病例B的PCR产物S和L片段(分别为354bp和218bp)的序列和分离出病毒序列完全一致。病例A的PCR产物S片段(199bp)有99.5%的核酸序列与病例B的一致,而且病例A的PCR产物L片段(218bp)与病例B的完全一致。8.系统进化分析显示:分离出的病毒的S序列与病例A和病例B的PCR产物序列聚集在一起。此外,病例E和病例F的PCR产物L片段与病例A及病例B的及分离到的病毒序列完全一致。因而我们考虑病例A、B、E、F和分离到的病毒有共同的起源。结论1.SFTSV因为血液暴露从原发患者传染至继发患者。2.3位SFTSV隐性感染者为近期的感染,考虑是因接触继发患者的体液及粘膜所致。第二部分发热伴血小板减少综合征病毒载量与病情相关性研究目的:1.探讨发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)在人体内存在的时限。2.研究SFTSV病毒载量与病情的严重程度及预后的相关性。方法:1.自2015年5月至2016年10月,在威海市中心医院感染性疾病科收集住院SFTS患者血样标本125例。标本采集离心后吸取血清上清液保存于-70℃直至用于提取病毒RNA。并对其中46例患者入院期间连续采取血清。2.收集临床资料包括有无合并症,包括神经系统症状(包括淡漠、嗜睡、昏迷、抖动、抽搐等)、出血倾向(包括皮肤瘀点、肺出血、柏油样便、弥散性血管内凝血)、严重心肌损害(CK-MB>2倍正常值上限)及肺炎的发生率。3.收集患者的实验室指标:白细胞、血小板、肝功、肾功、心肌酶、电解质、血凝常规。4.提取血样标本中的病毒RNA,提取后收集到无菌EP管中待用。5.采用实时荧光定量PCR的方法对提取的病毒RNA检测SFTSV载量。6.其中46例进行SFTSVRNA的动态分析,观察SFTSVRNA在人体内存在的时限及与病情的相关性。7.根据SFTSVRNA定量分成低病毒载量组(<104copies/mL)和高病毒载量组(≥104copies/mL),对比分析两组并发症发的发生率和实验室指标的差异,及与预后的相关性。8.使用SPSS17.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料用x±s表示,非正态分布的计量资料采用中位数(M)和上下四分位数表示(P25,P75),计数资料用例(百分率)表示;方差齐采取t检验,方差不齐采取秩和检验。结果:1.一般资料:125例患者男64例,女61例,平均年龄(59.0±3.6)岁,治愈101例,死亡24例。2.两组SFTSVRNA定量比较:低病毒载量组81例,SFTSVRNA载量为(3.08±1.01)拷贝/mL,高病毒载量组有44例,SFTSVRNA载量为(5.69±0.99)拷贝/mL,两组比较差异有统计学意义(t=11.78,P<0.05)。3.对46例患者进行SFTSV的动态检测,显示发病1周后大多数患者的病毒量开始下降,至发病23天后,均转为阴性。4.两组神经系统症状、出血倾向、严重心肌损害及肺炎的发生率分别为4.76%、0%、0%、2.47%和90.9%、40.9%、70.5%、68.2%,两组比较有统计学意义(χ2=92.987、38.711、75.889、54.680,均P<0.05)。死亡患者病毒载量在1.06×104~5.78×107拷贝/mL之间。5.125例患者WBC总数均减少,为(0.67～3.91)×109/L,<104cop/ml组和≥104cop/ml组的WBC总数分别为(2.35±1.03)×109/L和(1.94±0.97)×109/L,两组比较差异无统计学意义(t=0.181,P>0.05)。6.125例患者PLT总数均减少,为(10～88)×109/L,两组PLT总数分别为(58±21)×109/L和(38±22)×109/L,两组比较差异有统计学意义(t=2.869,P<0.05)。7.两组患者肝功、肾功能比较:1.两组的ALT、BUN、Cr、UA比较差异无统计学意义(Z/t=-1.019,-0.702、-1.212、1.892,均P>0.05);2.两组的AST、GGT比较差异有统计学意义(Z/t=-2.612、-2.015,均P<0.05)。8.两组的肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶和羟丁酸脱氢比较差异均有统计学意义(Z=-1.985、-3.279、-3.126、-2.152,均P<0.05)。9.两组的电解质及血糖比较:1.两组的血钠、血钙和血糖比较差异均有统计学意义(Z/t=2.666、2.612、-2.321,均P<0.05);2.两组的血钾和血氯比较差异均无统计学意义(z/t=1.4