“瓜蒌-薤白”药对对大鼠抗急性心肌缺血的药效学研究

“瓜蒌-薤白”药对对大鼠抗急性心肌缺血的药效学研究#摘要：目的探讨瓜蒌薤白（TKAM）配伍前后对大鼠抗急性心肌缺血的药效学研究。方法：大鼠随机分成5组，结扎冠状动脉左前降支造成大鼠急性心肌缺血损伤模型，分别给以生理盐水、瓜蒌、薤白、及配伍后的瓜蒌-薤白药对进行干预14d后，观察模型动物心电图S-T段变化；测定血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）水平；采用TTC染色测定心肌梗死面积；对心肌组织进行HE染色观察心肌坏死组织病理变化。结果配伍后的瓜蒌薤白药对，对大鼠抗急性心肌缺血模型心电图的S-T段抬高具有更加明显的对抗作用，可降低血清中LDH、CK的活性和MDA的含量，升高血清SOD的活性，明显缩小心肌梗死范围、保护心肌组织。结论瓜蒌与薤白配伍后抗急性心肌缺血所致的心肌损伤的效果更为显著。关键词：药效学；瓜蒌；薤白；急性心肌缺血；心肌梗死StudyonpharmacodynamicsofTrichosanthesKirilowiiMaximandAlliummacrostemononAntiacutemyocardialischemiainrats.LeiYan,HuangFang,HanLintao,DanHanxiong,LiangWei,WangYawei(HubeiUniversityofChineseMedicineCollegeofpharmacy,WuHan430065)Abstract:

ObjectiveToapproachtheeffectsofTrichosanthesKirilowiiMaximandAlliummacrostemonBge(TKAM)onantiacutemyocardialischemiainrats.MethodsRatsweredividedinto5groupsrandomly,ligationcoronaryarteryoftheleftanteriordescending(LAD)25303540

causeacutemyocardialischemiainratsdamagemodel.Respectivelytophysiologicalsaline,TrichosanthesKirilowiiMaxim,Alliummacrostemon,andcompatibilityofTKAMtointervene14d,toobservethechangeofS-Tsegmentwereobserved;determinationthelevelsofmaleicdialdehyde(MDA),superoxidedismutase(SOD),theactivityofthelactatedehydrogenase(LDH)andtheactivityofcreatinekinase(CK)inserum,bytetrazoliumchloride(TTC)Staining,theareasofmyocardialinfractionwereobserved;andthecardiacmuscletissuewasstainedbyHEtoobserveitsnecrosisareaandpathologicalchanges.ResultsAftercompatibilityoftrichosantheskirilowiimaximandAlliummacrostemonBge,theinhibitoryeffectsoftheratswithacutemyocardialischemiamodelresistanceelectrocardiogramS-Tsegmentelevationshasmoresignificant,canreduceserumLDH、CKactivityandMDAcontent,increaseserumSODactivity,significantlyreducemyocardialinfarctionscope,protectmyocardialtissue.ConclusionsAfterTrichosanthesKirilowiicompatibilitywithAlliummacrostemonBge,theacutemyocardialischemiacausedbytheeffectofmyocardialinjuryismoresignificant.Keywords:pharmacodynamics;TrichosanthesKirilowiiMaxim;AlliummacrostemonBge;acutemyocardialischemia-reperfusion;theareasofmyocardialinfraction0引言薤白为百合科植物小根蒜(AlliummacrostemonBge,AM)或薤AlliumchinenseG.Don的干基金项目：国家自然科学基金（81102846，31100267）；教育部科学技术研究重点项目（211112）；教育部高校博士学点基金新教师类（20114230120002）作者简介：（1988-），女，湖北中医药大学药学院10级硕士，研究方向为天然产物的药效学和毒理学研。Email:185630885@通信联系人：，（1976-），男，博士，湖北中医药大学中药资源与中药复方教育部重点实验室，副研究员，研究方向为中药物质基础与作用机理研。Email:hanlt711@163.com.-1-

燥鳞茎；瓜蒌为葫芦科植物栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim,TK)或双边栝楼TrichosanthesrosthorniiHarms的干燥成熟果实。临床研究证实，薤白具有显著的对心肌缺氧缺血时心肌45505560657075

损伤的保作用[1-2]、调血脂、抗动脉粥样硬化[3-4]、抑制血小板聚集及抗氧化作用[5-6]；瓜蒌具有扩张冠状动脉，增加血流量，提高耐缺氧能力[7]。本研究的前期研究发现，瓜蒌-薤白可改善大鼠心肌缺血后心肌收缩和舒张功能，减轻心肌病理性损伤，提示其具有较好的抗心肌缺血所致胸痹的保护作用。因此，从传统的中医理论和实验研究来看，瓜蒌-薤白配伍后将产生良好的治疗心肌缺血作用。本研究采用结扎冠状动脉左前降支造成大鼠急性心肌缺血损伤模型，分别给以生理盐水、瓜蒌、薤白、及配伍后的瓜蒌-薤白药对进行干预的方法，进一步探讨该方对急性心肌缺血的心肌损伤的保护作用。1实验材料1.1实验动物与药品健康SD雄性大鼠，体重150~200g，清洁级，由华中科技大学同济医学院提供，合格证号：SCXK（鄂）2010-0007。瓜蒌实、薤白药材购自于武汉刘有余药业有限责任公司。“瓜蒌-薤白”药对和单味药均由湖北中医药大学中药资源与中药复方教育部重点实验室自制。瓜蒌煎液：取瓜蒌皮250g、瓜蒌籽250g与12%乙醇600ml共煎，减压浓缩至400ml；薤白煎液：薤白250g与12%乙醇600ml共煎，减压浓缩至400ml。瓜蒌-薤白煎液：取瓜蒌实和薤白（500g:250g）与低浓度米酿酒1400mL共煎，减压浓缩至400mL，按比例制备足够数量，保存在-20℃冰箱中。为确保实验结果的可比性，同一样品的所有实验都用同一批药材。含生药量：瓜蒌TK（1.25g/ml）、薤白AM（0.625g/ml）、瓜蒌-薤白煎液TKAM（1.875g/ml）。氯化钠注射液，0.9%，250ml:2.25g，武汉市滨湖双鹤药业有限责任公司，批号：120120905；水合氯醛，中国上海白鹤化工厂生产，批号20090101；伊文思蓝，国药集团化学试剂有限公司生产，批号WC20090321；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）,生工生物工程（上海）有限公司；4%多聚甲醛液，2.5%戊二醛：赛莫飞世尔生物化学制品有限公司，批号NUH0180，201011563。1.2主要仪器BL-420S生物机能试验系统，成都泰盟科技有限公司；HX-100E小动物呼吸机，成都泰盟科技有限公司；OPTEC奥特光学BK5000生物显微镜,日本尼康公司；全自动生化分析仪HITACHI7080，日本HITACHI公司；LKB—V型超薄切片机，瑞典BROMMA公司；日立H—600型透射电镜，日本日立公司；冷冻离心机；-80℃低温冰箱。2实验方法2.1实验分组大鼠50只随机分为5组：假手术（SHAM）组﹑TKAM组（18.75g/kg）﹑TK组（12.5g/kg）﹑AM组（6.25g/kg）﹑模型（I/R）组，每组10只，假手术组和模型组灌胃生理盐水，各组每日灌胃一次，灌胃容量10ml/kg，连续灌胃14d。灌胃后，假手术组不进行任何手术操作，模型组只进行造模。-2-

80859095100105110115

2.2造模方法用10%水合氯醛（3mL/kg）ip麻醉，固定，采用标准肢体Ⅱ导联连续心电监测。气管插管，连接小动物呼吸机，呼吸频率60次/min，呼吸量1.5ml/100g。在左胸第四肋间处切开胸壁，并沿胸骨左缘2mm处切开第3、4肋骨，切开心包膜后轻轻挤压胸壁，暴露心脏，用医用无损伤针（3/0）在平左心耳下缘1~2mm处，经左冠状动脉左前降支下浅层心肌穿一5/0号丝线，假手术组仅穿线不结扎，其余各组均立即打活结结扎冠状动脉左前降支（Leftdesendingcoronaryartery，LAD），以同步心电图ST段抬高及心脏局部紫绀为结扎成功标志，形成急性心肌缺血[8]。迅速将心脏送回胸腔，排出血液和气体，关闭胸腔，持续观察导联心电图至结扎LAD30min后结束。其中，观察3个点的S-T段抬高值：缺血0min（观察是否造模成功）、15min（观察各组S-T段抬高值的区别）、30min（判断各组S-T段抬高值是否具有一定的差异，从而判定各给药组抗心肌缺血的效果）。2.3血样和组织标本采集与检测各组在灌胃14d后，除SHAM组外，其余各组均进行手术造模。在大鼠急性心肌缺血造模成功后，观察心电图30min（即缺血30min）完毕时，于腹主动脉取血，后取出心脏，用生理盐水清洗淤血。血液于3000r/min，离心l0min，取上清液（即血清）–20℃保存，采用全自动生化分析仪检测血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）等指标。取心脏缺血组织用4%多聚甲醛液固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，HE染色，梯度乙醇脱水，封片，于光学显微镜下观察（×200）。取心肌组织固定于2.5%戊二醛，0.1M磷酸缓冲液漂洗三次，再用锇酸（O3O41%）固定，0.1M磷酸缓冲液漂洗三次，梯度酒精脱水（50%，70%，80%，95%，100%二次）每次15分钟。纯丙酮脱水二次（15分钟），EPON812：丙酮（1：1）浸透30分钟，纯包埋液浸透1小时，纯包埋液固化37度24小时后60度48小时。瑞典BROMMA公司产LKB—V型超薄切片机切片，铀、铅染色（醋酸双氧铀，枸橼酸铅）。日本日立公司生产的日立H—600型透射电镜观察。（×15000）2.4心肌梗死面积测定每组取一只大鼠进行颈总动脉插管，且均在缺血30min后，经颈动脉插管缓慢注入1%伊文思蓝2~3mL（其中SHAM组不缺血，但在插管30min后进行染色），将非缺血心肌染成蓝色。10min后，取出心脏用磷酸缓冲液（PBS，pH7.8）冲洗，剪去心房，置于–20℃冰箱冷冻。20min后取出按垂直于左心室长轴方向切片，自心底至心尖依次定为A片、B片、C片、D片、E片，每片面向心底为a面，面向心尖为b面，置于1%氯化三苯基四氮唑（TTC）磷酸缓冲液中，室温染色。20min后，用4%多聚甲醛液固定24h。取出，用滤纸吸干称重。将a，b两面彩色扫描，图像输入电脑保存。扫描后保存于甲醛中，随后石蜡包埋。心肌非缺血区染成蓝色，缺血区呈红色，缺血梗死区呈灰白色，用Image-ProPlus图像分析软件（Version6.0,MediaCybemeticsLP,USA）分别测定心肌片a，b两面梗死区和缺血区面积占整片心肌切面的百分比，两面的面积百分比平均后乘以该片心肌的重量得出该片心肌梗死区重量和缺血区重量，把每只鼠的五片心肌缺血区重量总和后除以左心室重量，梗死区重量总和后除以心肌缺血区总重量，即得该鼠的心肌缺血面积（AreaatRisk/LV，AAR/LV）和梗死面积（Infarctsize/AreaatRisk，IS/AAR）[9-11]。-3-

2.5统计学处理实验数据以均数±标准差（X±s）表示，使用SPSS17.0统计学软件进行分析，组间数120125

据比较用单因素方差分析，组间两两比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01认为差异有显著性。3结果与分析3.1瓜蒌薤白对急性缺血过程中心电图S-T段的影响模型组大鼠心电图出现明显波形改变，S-T段异常抬高，给药组，即瓜蒌组，薤白组和瓜蒌薤白组与模型组比较，有降低结扎冠脉后S-T段上移的作用，且作用依次增加（P<0.05），表明瓜蒌薤白药对对冠脉结扎所致的大鼠心肌缺血具有预防作用（表1）。表1瓜蒌薤白对大鼠心电图中S-T段的影响(X±S,n=10)Table1.EffectsofTKAMonS-TlevelsofECGafterI/R组别

n

正常（mV）

缺血（mV）0min15min30minSHAM10I/R10TK10AM10TKAM10

0.11±0.010.13±0.010.14±0.020.13±0.010.11±0.010.21±0.01##0.31±0.05##0.45±0.05##************130135140

3.2瓜蒌薤白对大鼠血清CK﹑LDH﹑SOD活性及MDA含量影响与SHAM组比较，I/R组血清CK﹑LDH的活性和MDA含量明显升高（P<0.01或P<0.05），血清SOD活性明显降低（P<0.05），提示造模成功。与I/R组比较，TKAM组能明显降低大鼠血清CK﹑LDH活性和MDA含量，升高SOD活性（P<0.05或P<0.01）。与I/R组相比，TK组能够显著降低大鼠血清CK﹑LDH的活性（P<0.05或P<0.01），显著减少MDA的生成量（P<0.01）；AM组能够明显降低LDH的活性和减少MDA的生成量，升高血清SOD的活性（P<0.05），见表2。表2瓜蒌薤白对大鼠血清CK﹑LDH﹑SOD活性及MDA含量的影响(±S,n=5)Table2.EffectsofTKAMonserumlevelsofCK,LDH,SODandMDAafterI/R组别

剂量(g·kg-1)

CK(U·L-1)

LDH(U·L-1)

SOD(U·mL-1)

MDA(μmol·L-1)SHAM

-1946.00±144.69413.60±108.04172.40±33.46

2.88±0.86I/RTKAMTKAM

-2715.00±408.33##**6.252061.00±130.95**18.751897.40±102.65**

624.60±152.81##615.40±106.35**544.60±149.47**525.20±152.51**

80.60±18.6996.40±13.70105.40±16.07130.80±30.90

8.18±1.87##7.24±2.38**7.02±1.29**4.86±0.99**3.3瓜蒌薤白对大鼠心肌缺血面积和梗死范围的影响145

本实验LAD结扎的30Min成功复制了急性心肌缺血的病理模型，模型组出现明显心肌缺血梗死。与模型组比较，给药组，即：TK组，AM组，TKAM组均可使梗死百分率明显减少，且梗死百分率依次降低，说明瓜蒌-薤白药对能够缩小缺血心肌梗死范围，对大鼠急-4-0.35±0.02**0.30±0.050.11±0.010.20±0.010.42±0.04**0.34±0.020.12±0.020.25±0.020.32±0.04**0.27±0.010.11±0.010.18±0.010.35±0.02**0.30±0.050.11±0.010.20±0.010.42±0.04**0.34±0.020.12±0.020.25±0.020.32±0.04**0.27±0.010.11±0.010.18±0.01注：与SHAM组比较，P<0.05，P<0.01；与I/R组比较，*P<0.05，**P<0.0112.52186.00±245.41注：与SHAM组比较，P<0.05，P<0.01；与I/R组比较，*P<0.05，**P<0.01性心肌缺血具有保护作用（表3）。

150

表3瓜蒌薤白对大鼠心肌缺血面积和梗死范围的影响(±S,n=5)Table3.EffectsofTKAMonratmyocardialischemiaandinfarctionarearangeofinfluenceSHAM

I/R

TK

AM

TKAMBodyweight(g)LVweight(g)AreaatRisk(g)InfarctSize(g)

190±11161±11157±9163±80.119±0.0600.148±0.0530.160±0.0670.154±0.091-0.059±0.0290.058±0.0320.051±0.020-0.035±0.0170.030±0.0070.023±0.013

162±110.133±0.0840.049±0.0290.023±0.017AAR/LV(%)

-52±7##**

39±13##**

37±18##**

33±6##**IS/AAR(%)

##**

60±22

##**

48±32##**

42±9##**图1

TTC染色后急性心肌缺血大鼠心肌切片的A，B面，1：I/R组；2：TK组（12.5g/kg）；3：AM155

组（6.25g/kg）；4：TKAM组（18.75g/kg）Fig.1EffectofTKAMinantiacutemyocardialischemiaTTCstainedsectionoftheheartobtainedfromSham(A),I/R(B),TK12.5g/kg(C),AM6.25g/kg(D),TKAM18.75g/kg(E)3.4瓜蒌薤白对大鼠急性缺血心肌组织学的影响160

图2

HE染色后光镜下大鼠急性心肌缺血心肌组织切片（×200）,A:SHAM组;B:I/R组;C:TK组（12.5g/kg）;D:AM组(6.25g/kg);E:TKAM组（18.75g/kg）Fig.2Representativelightmicroscopeappearanceofratmyocardialhistopathologicalmorphology(hematoxylinstaining;originalmagnification×200)forSham(A),I/R(B),TK12.5g/kg(C),AM6.25g/kg(D),TKAM18.75g/kg(E)-5--59±20注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与TKAM组比较，P<0.05，P<0.01-59±20注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与TKAM组比较，P<0.05，P<0.01

165170175180185190

A：SHAM组，为正常心肌细胞的纵切面，横纹清晰，心肌细胞排列整齐，细胞完整，核居中，无明显变性坏死，间质无炎细胞浸润，无水肿。B：I/R组，主要表现为心肌广泛水肿，间质增宽，心肌细胞排列扭曲，细胞核散在，小灶性心肌细胞变性坏死，坏死处心肌细胞肌浆溶解或空泡变，局部有炎细胞浸润，部分区域心肌间质血管扩张充血，心肌细胞包浆淡染。C：TK组，较模型组稍有改善，心肌纤维有轻度断裂，排列扭曲，有细胞结构不完整，可见部分水肿和炎细胞。D：AM组，心肌纤维结构排列较TK组排列整齐，无明显扭曲，但细胞间质水肿明显，少量胞核边集，边缘不清。E：TKAM组，细胞轮廓完整，肌节排列较整齐，轻度水肿，肌纤维间可见少量炎细胞浸润，较以上各组均有改善，形态规则。见图2。图3电镜下大鼠急性心肌缺血心肌组织切片（75kvx15000）,A:SHAM组;B:I/R组;C:TK组（12.5g/kg）;D：AM组(6.25g/kg):E:TKAM组（18.75g/kg）Fig.3Byelectronmicroscopyratacutemyocardialischemicmyocardialtissuesection(75kvx15000)forSham(A),I/R(B),TK12.5g/kg(C),AM6.25g/kg(D),TKAM18.75g/kg(E)A：SHAM组，为正常心肌细胞，润盘清晰可见，肌纤维组织排列整齐。B：I/R组，线粒体极度肿胀，灶空化，嵴排列凌乱或崩解，肌纤维扭曲。C：TK组，较模型组稍有改善，肌纤维排列扭曲，可见部分灶空化和嵴排列紊乱。D：AM组，肌纤维结构无明显扭曲，细胞间质有水肿。E：TKAM组，线粒体有轻度肿胀，肌纤维排列整齐。见图3。4讨论心肌缺血损伤在中医学中属于“胸痹”、“心痛”等范畴。瓜蒌-薤白药对出自于《金匮要略·胸痹》篇，是临床治疗胸痹的有效方。药理研究表明[12-13]，该方可以通过调节血管内皮细胞产生的一氧化氮和内皮素平衡有效防治急性心肌缺血损伤。结扎冠状动脉左前降支导致急性心肌缺血是一种简易的造模方法，广泛用于急性心肌缺血的实验研究。结扎冠脉能导致血压升高，心脏后负荷加重；同时，心脏灌流不足，而导致了心肌缺血缺氧，降低心脏功能，从心电图可见急性心肌缺血的典型心电图变化。急性心肌缺血是由于冠状动脉痉挛，心肌供血供氧不足导致心肌代谢异常而导致的一种病理状态，可引起心绞痛，心肌梗死等严重心脏疾病[14]。心肌缺血时，心肌代谢异常，表现为高能量磷酸化合物的代谢、糖酵解与氧化磷酸化作用、细胞内钾离子丢失及钙稳态的变化。缺血过程中磷脂酶激活，产生具有膜活性的游离脂肪酸，可破坏细胞膜；并有大量儿茶-6-

195200205210

酚胺释放，游离脂肪酸产生，以及白细胞释放的自由基均能导致细胞质膜损伤和通透性增加，而引起心肌酶的释放增加[15]。CK、LDH是实验和临床均公认的对心肌缺血有诊断意义的酶，可作为判断心肌缺血损伤程度的指标。心肌缺血的最根本的防治措施仍然是改善血液供应，降低心脏耗氧，通过清除或对抗有害物质对心肌的不良影响以保护心肌。本实验通过对瓜蒌-薤白药对的应用，从各组心电图S-T段、心肌酶、心肌梗死面积以及心肌组织学的表达结果可以看出，大鼠结扎LDA后心肌缺血造模成功。结果显示，瓜蒌-薤白药对能够改善急性心肌缺血引起的心电图的S-T段的变化，降低CK、LDH含量，降低MDA水平，升高SOD水平，减小心肌梗死面积，改善受损的心肌组织，对急性心肌缺血有良好的保护作用；从本观察结果看出，TK组，AM组和TKAM组中，综合来看，与I/R组相比，TKAM组的减小心肌梗死范围，以及改善受损心肌组织的程度较为明显（P<0.05）。提示瓜蒌-薤白药对具有肯定的抗心肌缺血作用，值得进一步在质量控制等环节深入研究，以提高疗效。此外，急性心肌缺血与MAPKs通路也有着密切的联系，且其作用机制有待更进一步的探讨。致谢感谢父母和家人对我的培养和支持；感谢本课题论文在韩林涛副研究员的悉心教导下和同学严标文和李明明的帮助下完成，也感谢两位本科生梁伟和王亚伟对本次实验的帮助！[参考文献](References)[1]

吴波,陈思维,曹虹,王敏伟.薤白提取物对心肌缺氧缺血及缺血再灌注心肌损伤的保护作用.沈阳药科大学学报.200