AtRAN1在拟南芥种子发育过程中的功能研究

摘要拟南芥（Arabidopsisthaliana）的种子由胚，胚乳和种皮三部分结构组成。种子的发育可以分为前期和后期两个阶段：在前期中，胚乳分裂速度较快，胚生长较慢；在后期中，胚利用胚乳的营养快速生长最终发育成熟，而胚乳逐渐被吸收利用最终消失。种子的发育受父母本基因组互作调控，即胚乳中父母本的基因组组成偏离正常1:2比例时，胚乳的发育出现异常，进而导致种子的发育异常。父母本基因组互作与基因印记现象紧密相联。基因印记是两个亲本来源的等位基因在后代体细胞中有不同的表达活性的现象，在植物中出现在胚乳组织的发育过程中。然而，在植物中对于基因印记在种子发育中的作用还不清楚。本论文发现，AtRAN1作为拟南芥小G蛋白RAN家族成员之一，与基因印记相关。实验结果表明：AtRAN1在间期主要在细胞核中定位，在有丝分裂期与纺锤体和成膜体有一定共定位。在生殖生长过程中AtRAN1在雌雄配子体及种子中均有表达并且控制着种子的大小。在AtRAN1下调表达的突变体株系与野生型（WT）正反交试验中，当突变体作为母本授予WT花粉时，所结种子致死。当WT作为母本授予突变体的花粉时，种子体积减小。在AtRAN1过表达的株系与WT正反交中，种子也出现致死的表型。但是，过表达株系自交及突变体自交所结的种子相对正常，说明种子的发育可能与AtRAN1父母本的表达量比例相关，预示着AtRAN1可能是一类印记基因。对父母本AtRAN1在胚乳中表达模式的分析表明，父本的AtRAN1在胚乳发育的后期受到抑制，这表明在拟南芥的胚乳发育中AtRAN1是一个母本表达的印记基因。当AtRAN1父母本表达量比例发生改变以致种子发育致死时，AtRAN1在胚乳中表达模式发生改变，说明AtRAN1在胚乳中的表达模式与AtRAN1父母本表达量比例相关。同时，AtRAN1在胚乳中表达过量或不足均导致胚乳细胞化时间发生改变。当AtRAN1在胚乳中表达量过高时，细胞化延迟或不发生。当AtRAN1表达量降低，细胞化提前发生。两种情况最终均影响种子的生长发育。AtMINISEED3（AtMINI3）编码一类转录因子，调节胚乳细胞化发生时间早晚。我们发现AtMINI3在种子发育中的表达量与AtRAN1有一定的相关性，可能是AtRAN1的下游作用因子之一。总之，我们的研究表明，AtRAN1作为一个新的印记基因，通过AtRAN1在胚乳中的表达量来调节胚乳细胞化的起始和种子的发育。关键词：种子；AtRAN1；小G蛋白；父母本比例；印记基因；胚乳；细胞化AbstractArabidopsis（Arabidopsisthaliana）lifecycleexperiencedthevegetativegrowthandthereproductivegrowth.Arabidopsisseedscouldbedividedintothreeparts:theembryo,endospermandtesta.SeeddevelopmentinArabidopsisthalianaundergoesaninitialphaseofendospermproliferationwhiletheembryogrowsslowlyfollowedbyasecondphaseinwhichtheembryogrowsfastbytakingadvantageoftheendospermnutrient.Parentalgenomeinteractionisimportantforseedgrowth,reflectedby1:2proportionofthepaternaltomaternalgenomemustbemaintainedinendospermdevelopmentotherwisetheseedswoulddevelopedabnormaly.Themolecularmechanismsoftheparentalgenomeinteractionstillneedtobeclarified.Parentalgenomeinteractionisassociatedwithgeneimprinting.Imprintedgenesaregenesexpressedprimarilyorexclusivelyfromeitherthematernalorpaternalallele,whichisessentialforembryodevelopmentinfloweringplantsandmammals.However,thefunctionofgenomicimprintingisunclear.Inthisstudy,asmallRAN-likeGTPasefromArabidopsis,AtRAN1,wasfoundtoexpressingametophyteanddevelopingseedinArabidopsis.Insub-cellularlocalization,AtRAN1isanucleusproteinininterphase,inmitosisitiscolocalizedwithspindleandphragmoplast.AtRAN1isubiquitouslyexpressedduringvegetativegrowthinArabidopsis.DownregulationofAtRAN1leadstosmaller-sizeflowersandseeds,indicatingthatAtRAN1hasaroleinseeddevelopment.However,inAtRAN1knock-downline（r1-2）crossedwithWTpollen,theseedsabort.Onthecontrary,whenWTiscrossedwithr1-2pollen,theseedsaresignificantlysmall.ThereciprocalcrossesofWTanddifferentAtRAN1overexpressionlinesindicatetheparentalAtRAN1ratiowouldbeimportantforendospermdevelopment.ThereciprocalcrossesofWTandAtRAN1promoterdrivingGUSline（pRAN1::GUS）showthatthepaternalexpressionofpRAN1::GUSisprohibitedinendosperminlaterendospermdevelopmentstage,whichindicatesthatAtRAN1isapredominantly-maternallyexpressedimprintedgene.Theproperexpressionof

AtRAN1

inendospermiscriticalfortheonsetofcellularization.Inr1-2crossedwithWTpollen,theAtRAN1expressionisabnormallyhigh,andcellularizationisdelayed.InWTcrossedwithr1-2pollen,theAtRAN1expressionislow,andcellularizationhappensearlierthanWT.Afterexpressionexamination,AtMINISEED3(AtMINI3)ispositivelyrelatedwithAtRAN1andmaybethedownstreamfactorofAtRAN1.Inconclusion,ourstudiesdemonstrate

theparentalAtRAN1ratioandproperexpressionof

AtRAN1inendosperm

iscriticalforseedmaturation.KEYWORDS：seed;AtRAN1;parentalratio;imprinting;endosperm;cellularization缩写表RANRas-relatednuclearproteinGTPGuanosinetriphosphateCDSCodingseqencebpBasepairkDKilodaltonBY-2Brightyellowcell-2GUSβ-glucuronidasedNTPDeoxyribonucleosidetriphosphatePCRPolymerasechainreactionRT-PCRReversetranscriptPCRqRT-PCRQuantitative-realtimePCRDAPDaysafterplantDAHDaysafterhand-pollinationMCEMicropyleendospermCZEChalazalendospermPENPeripheralendpsermNCDNucleuscytoplasmdomainRFPRedfluorescenceproteinGFPAMGreenfluorescenceproteinAverage100seedseedmassDICDifferentialinterferencecontrastAmpAmpicillinKanKanamycinHygHygromycin目录MACROBUTTONAcceptAllChangesInDoc摘要 IAbstract III第一章文献综述 11.1被子植物的种子发育过程 11.2影响种子发育的遗传因素 51.2.1种子发育的调控基因 胚发育的调控基因 胚乳发育的调控基因 种皮发育的调控基因 胚，胚乳和种皮发育的相互影响 81.2.2种子发育的表观遗传调控 父母本基因组互作 基因组印记和印记基因 111.3小G蛋白RAN概述 131.3.1小G蛋白的概述和分类 131.3.2RAN的结构和功能 14本研究的目的和意义 19第二章材料和方法 202.1材料 202.1.1植物材料 202.1.2载体、菌株 202.1.3试剂、药品 202.1.4溶液 GUS染色溶液 花粉萌发液 种子透明液 观察胚乳细胞化所用溶液 培养基 抗生素 222.1.5仪器与设备 232.2方法 232.2.1分子生物学相关方法 拟南芥幼苗RNA提取 23种子RNA提取 RT-PCR T-DNA插入突变体精确插入位置鉴定及纯合体鉴定原理 目的基因的扩增 PCR产物的回收和纯化 2载体构建 2农杆菌感受态细胞的制备和外源基因转化 272.2.2细胞生物学方法 2胚乳细胞化的观察步骤 2种子透明化的观察步骤 2基因枪瞬时转化步骤 2农杆菌介导的拟南芥悬浮细胞和烟草BY-2悬浮细胞转化步骤 2拟南芥悬浮细胞免疫荧光标记步骤 30细胞的DAPI染色 3荧光显微镜观察方法 3浸花法构建转基因植物步骤 3植株GUS染色步骤 30拟南芥植株表型的观察与统计 322.2.3序列比对 332.2.4数据和图象处理 33第三章结果与讨论 343.1结果 343.1.1AtRAN1CDS序列的克隆及AtRAN1真核表达载体的构建 343.1.2AtRAN1的亚细胞定位 3AtRAN1在洋葱表皮细胞中的定位 3AtRAN1在BY-2细胞及拟南芥悬浮细胞中的定位 3AtRAN1在拟南芥植株体细胞中的定位 383.1.3AtRAN1的突变体插入位点鉴定和组织特异性分布观察 393.1.4AtRAN1的突变体植株表达水平鉴定 423.1.5AtRAN1的突变体植株表型分析 433.1.6AtRAN1的过表达植株表达水平鉴定和表型分析 453.1.7AtRAN1对种子子叶细胞数目和细胞大小的控制 473.1.8AtRAN1过表达植株地上部分表型鉴定 483.1.9AtRAN1突变体与WT正反交证明AtRAN1影响胚乳的发育 503.1.10AtRAN1父母本的表达量比例控制着胚乳发育 553.1.11AtRAN1在胚乳发育中是一个母本表达的印记基因 573.1.12AtRAN1的表达量控制着胚乳细胞化的起始 593.1.13AtRAN1调节控制细胞化的关键基因AtMINI3的表达 623.2讨论 663.2.1AtRAN1在胚乳发育过程中是一个新的印记基因 663.2.2AtRAN1的表达量在胚乳发育过程中决定细胞化的起始 683.2.3结论 70参考文献 71致谢 80第一章文献综述1.1被子植物的种子发育过程被子植物的种子由合子发育而来，而合子的发育过程起始于植物界中特有的双受精过程（double-fertilization）。双受精的具体过程是当被子植物的花粉管到达胚囊后，花粉管顶端破裂，释放出两个精细胞和花粉管内容物质，其中一个精细胞与卵细胞融合形成合子，将来发育成胚（embryo）；另一个精细胞与中央细胞的两个极核融合形成初生胚乳核，将来发育成胚乳（endosperm）。图1-1.拟南芥未受精的胚囊和发育中的种子示意图（Sundaresan,2005）UnfertilizedOvule：未受精的胚囊。绿色圆点代表合子。棕色代表珠被。蓝色圆点代表中央细胞。DevelopingSeed：发育中的种子。绿色心形结构代表胚。棕色代表珠被。浅棕色代表胚乳。MatureSeed：成熟种子。绿色代表胚。棕色代表种皮。浅棕色代表胚乳。被子植物的种子由胚、种皮和胚乳组成。其中，胚由受精卵发育而来，而种皮来源于母本孢子体的珠被结构，胚乳起源于受精的极核（图1-1）。胚乳占据着种子的绝大部分体积。在禾谷类种子和主要油料作物种子中，胚乳是种子营养物质的贮藏场所。双子叶植物的胚乳在胚的成熟过程中被胚自身的一部分即子叶吸收利用，而单子叶植物的胚乳直到种子成熟仍为游离的胚乳核。目前，单子叶植物禾谷类例如水稻，小麦和玉米等的成熟胚乳约承担世界60%的粮食供应，是人类粮食的主要来源ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Berger</Author><Year>2009</Year><RecNum>342</RecNum><DisplayText>(张莉etal.,2004;BergerandChaudhury,2009)</DisplayText><record><rec-number>342</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">342</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Berger,Fred</author><author>Chaudhury,Abed</author></authors></contributors><titles><title>Parentalmemoriesshapeseeds</title><secondary-title>Trendsinplantscience</secondary-title></titles><periodical><full-title>Trendsinplantscience</full-title></periodical><pages>550-556</pages><volume>14</volume><number>10</number><dates><year>2009</year></dates><isbn>1360-1385</isbn><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>张莉</Author><Year>2004</Year><RecNum>343</RecNum><record><rec-number>343</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">343</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>张莉</author><author>毛雪</author><author>李润植</author></authors></contributors><titles><title>种子发育相关基因的研究进展①</title><secondary-title>植物学通报</secondary-title></titles><periodical><full-title>植物学通报</full-title></periodical><pages>288-295</pages><volume>21</volume><number>3</number><dates><year>2004</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>(张莉etal.,2004;BergerandChaudhury,2009)。随着世界人口的增加，对粮食的需求也大量增加,开展种子发育和育种相关领域的基础研究工作对作物改良和粮食增产具有重要意义。拟南芥（Arabidopsisthaliana）种子发育过程为：胚珠经过受精后，卵细胞发育成合子。合子首先经过一段时间的休眠期，便开始进行细胞分裂发育成胚。胚的整个生长时期可以按照形态发育先后顺序划分为：球形胚时期，心形胚时期，鱼雷形胚时期和子叶形胚时期。球形胚从受精卵的第一次横向不均等分裂开始，形成大小不等的两个细胞，靠近珠孔的细胞高度液泡化，称为基细胞；远离珠孔的细胞胞质较浓，称为顶细胞。基细胞继续进行多次横向分裂，形成单列多细胞的结构，称作胚柄。在胚柄不断生长过程的同时，顶细胞相应进行分裂。首先发生两次纵向分裂，形成包含4个细胞的胚。紧接着每个细胞进行一次横向分裂，产生由8个细胞组成的8细胞胚。然后,这8个细胞各进行一次平周分裂，形成8个外层的原表皮细胞和8个内层细胞，即此时的球形胚包含16个细胞，称为16细胞胚。当胚在不断生长的同时，胚乳也在生长发育。体现在胚乳核的快速分裂。被子植物胚乳的发育是从极核受精后即受精极核又叫胚乳核开始的。胚乳核初期分裂速度较快，当受精卵进行第一次分裂时，胚乳核已经分裂4-5轮，数目达到24-28个ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><RecNum>231</RecNum><DisplayText>(Boisnard-Lorigetal.,2001)</DisplayText><record><rec-number>231</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">231</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title><plantcell13.pdf></title></titles><dates></dates><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Boisnard-Lorig</Author><Year>2001</Year><RecNum>344</RecNum><record><rec-number>344</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">344</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Boisnard-Lorig,Corinne</author><author>Colon-Carmona,Adan</author><author>Bauch,Marion</author><author>Hodge,Sarah</author><author>Doerner,Peter</author><author>Bancharel,Estelle</author><author>Dumas,Christian</author><author>Haseloff,Jim</author><author>Berger,Frédéric</author></authors></contributors><titles><title>DynamicanalysesoftheexpressionoftheHISTONE::YFPfusionproteininArabidopsisshowthatsyncytialendospermisdividedinmitoticdomains</title><secondary-title>ThePlantCellOnline</secondary-title></titles><periodical><full-title>ThePlantCellOnline</full-title></periodical><pages>495-509</pages><volume>13</volume><number>3</number><dates><year>2001</year></dates><isbn>1040-4651</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(Boisnard-Lorigetal.,2001)（表1-1）。胚乳的发育进程较早于胚的发育，其重要意义是为幼胚的生长发育提供必需的营养物质，并对幼嫩的胚提供保护。胚利用这些营养物质不断发育，32细胞胚球形胚之后，球形胚顶端两侧部位的细胞分裂较快，形成两个突起即子叶原基，之后发育成子叶。此时整个胚体呈心形，称为心形胚。胚乳核经过核的多次分裂，已经达到多余200个的细胞核（表1-1）。这些核都不产生细胞壁而游离分散于胚囊中，即产生一个多核细胞合胞体（图1-2,1-3）。此时的每个胚乳核由一个胞质球和放射状的微管系统围绕，称为核质域（nucleuscytoplasmdomain-NCD）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Pignocchietal.,2009)。在合胞体时期，拟南芥胚乳可被分为三个区域：在珠孔端围绕胚的胚乳称为珠孔区胚乳（micropylarendosperm-MCE），在合点端的胚乳称为合点区胚乳（chalazalendosperm-CZE）以及位于珠孔胚乳与合点胚乳之间的胚乳称为外周胚乳（peripheralendosperm-PEN）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Boisnard-Lorig</Author><Year>2001</Year><RecNum>344</RecNum><DisplayText>(MansfieldandBriarty,1990;Boisnard-Lorigetal.,2001)</DisplayText><record><rec-number>344</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">344</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Boisnard-Lorig,Corinne</author><author>Colon-Carmona,Adan</author><author>Bauch,Marion</author><author>Hodge,Sarah</author><author>Doerner,Peter</author><author>Bancharel,Estelle</author><author>Dumas,Christian</author><author>Haseloff,Jim</author><author>Berger,Frédéric</author></authors></contributors><titles><title>DynamicanalysesoftheexpressionoftheHISTONE::YFPfusionproteininArabidopsisshowthatsyncytialendospermisdividedinmitoticdomains</title><secondary-title>ThePlantCellOnline</secondary-title></titles><periodical><full-title>ThePlantCellOnline</full-title></periodical><pages>495-509</pages><volume>13</volume><number>3</number><dates><year>2001</year></dates><isbn>1040-4651</isbn><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Mansfield</Author><Year>1990</Year><RecNum>345</RecNum><record><rec-number>345</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">345</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Mansfield,SG</author><author>Briarty,LG</author></authors></contributors><titles><title>EndospermcellularizationinArabidopsisthalianaL</title><secondary-title>ArabidopsisInf.Serv</secondary-title></titles><periodical><full-title>ArabidopsisInf.Serv</full-title></periodical><pages>65-72</pages><volume>27</volume><dates><year>1990</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>(MansfieldandBriarty,1990;Boisnard-Lorigetal.,2001)（图1-2）。图1-2.拟南芥胚乳区域的划分（Gehringetal.,2004）MCE：珠孔区胚乳。CZE：合点区胚乳。PEN：外周胚乳。EM：胚。图1-3.拟南芥胚乳发育阶段（Boisnard-LorigC.,2001）A-H.受精后的胚乳到心形胚时期的胚乳的发育情况。A.受精极核未分裂时。B.受精极核分裂一次。C.胚乳核分裂两次。D.胚乳核分裂三次。E.一细胞胚时期。F.四细胞胚时期。G.球形胚时期。H.心形胚时期。表1-1.拟南芥胚乳发育阶段和各阶段的胚乳细胞核数目统计（Boisnard-LorigC.,2001）EndospermDevelopmentalStage：胚乳发育阶段。No.ofEndospermNuclei：胚乳细胞核数目。EmbyoDevelopmentalStage：胚发育阶段。TimeafterFertilization：受精后时间（小时）。CytologicalEvents：细胞学事件。随着胚囊内中央液泡的形成与扩大，NCD被挤向胚囊的周缘，此时胚乳由围绕大的中央液泡的一层NCD组成。在胚由早心形胚时期向晚心形胚时期发育的时候，NCD周围开始出现细胞壁，称为胚乳细胞化ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Brownetal.,1999;Hehenbergeretal.,2012)。细胞化首先发生在MCE，然后是PEN发生细胞化。例外的是，CZE不发生细胞化ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(MansfieldandBriarty,1990;Brownetal.,1999;Boisnard-Lorigetal.,2001;Sørensenetal.,2002;FiumeandFletcher,2012)。细胞化的胚乳能供应后期胚发育所需的养分，也是种子发育的关键步骤，对种子的成熟意义重大。细胞化起始的分子机制现在还处于探索阶段，但相关的研究表明细胞化的起始与胚乳核分裂的数目有一定关系ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Guitton</Author><Year>2004</Year><RecNum>348</RecNum><DisplayText>(MansfieldandBriarty,1990;Guittonetal.,2004)</DisplayText><record><rec-number>348</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">348</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Guitton,Anne-Elisabeth</author><author>Page,DamianR</author><author>Chambrier,Pierre</author><author>Lionnet,Claire</author><author>Faure,Jean-Emmanuel</author><author>Grossniklaus,Ueli</author><author>Berger,Frédéric</author></authors></contributors><titles><title>IdentificationofnewmembersofFertilisationIndependentSeedPolycombGrouppathwayinvolvedinthecontrolofseeddevelopmentinArabidopsisthaliana</title><secondary-title>Development</secondary-title></titles><periodical><full-title>Development</full-title></periodical><pages>2971-2981</pages><volume>131</volume><number>12</number><dates><year>2004</year></dates><isbn>0950-1991</isbn><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Mansfield</Author><Year>1990</Year><RecNum>345</RecNum><record><rec-number>345</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">345</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Mansfield,SG</author><author>Briarty,LG</author></authors></contributors><titles><title>EndospermcellularizationinArabidopsisthalianaL</title><secondary-title>ArabidopsisInf.Serv</secondary-title></titles><periodical><full-title>ArabidopsisInf.Serv</full-title></periodical><pages>65-72</pages><volume>27</volume><dates><year>1990</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>(MansfieldandBriarty,1990;Guittonetal.,2004)，例如，由于某些因素导致胚乳细胞化发生的过早时，胚乳细胞核的数目往往比较少。而当胚乳细胞化发生的过晚时或不发生时，胚乳细胞核的数目往往比较多ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Scott</Author><Year>1998</Year><RecNum>21</RecNum><DisplayText>(Scottetal.,1998)</DisplayText><record><rec-number>21</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">21</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Scott,R.J.</author><author>Spielman,M.</author><author>Bailey,J.</author><author>Dickinson,H.G.</author></authors></contributors><titles><title>Parent-of-origineffectsonseeddevelopmentinArabidopsisthaliana</title><secondary-title>Development</secondary-title></titles><periodical><full-title>Development</full-title></periodical><pages>3329-3341</pages><volume>125</volume><number>17</number><dates><year>1998</year></dates><isbn>0950-1991</isbn><urls><related-urls><url>/content/125/17/3329.full.pdf</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(Scottetal.,1998)。胚乳包含过多的不发生细胞化的胚乳核和过少的胚乳核均会导致胚对胚乳的营养吸收出现问题而导致种子发育出现异常。因此，正常的细胞化起始时间对种子的发育至关重要，过早或过晚发生均影响种子的发育和最终形态。心形胚时期之后，子叶原基处细胞继续分裂生长延伸，形成两片形状大小相似的子叶。子叶基部的胚轴也相应伸长，这时整个胚体呈鱼雷形，叫做鱼雷形胚时期。鱼雷形胚时期之后，整个胚继续生长，子叶占据大部分胚囊，这时的胚体叫做子叶胚，继续发育为成熟胚。成熟胚占满了整个胚囊。此时的胚乳已经被胚完全吸收而消失或只剩下一层细胞ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(MansfieldandBriarty,1991;LopesandLarkins,1993;Weijersetal.,2001;Sundaresan,2005)。除了胚的发育和胚乳的发育，种皮的发育也十分重要。成熟的种子中种皮位于种子的最外层，是保护结构。拟南芥具有两层种皮，外种皮由外珠被发育而来，内种皮由内珠被发育而来。种皮的发育与胚的发育和胚乳的发育是相互影响相互联系的ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Sundaresan</Author><Year>2005</Year><RecNum>55</RecNum><DisplayText>(Sundaresan,2005)</DisplayText><record><rec-number>55</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">55</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Sundaresan,V.</author></authors></contributors><titles><title>Controlofseedsizeinplants</title><secondary-title>ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica</secondary-title></titles><periodical><full-title>ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica</full-title></periodical><pages>17887</pages><volume>102</volume><number>50</number><dates><year>2005</year></dates><isbn>0027-8424</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(Sundaresan,2005)（图1-1）。1.2影响种子发育的遗传因素种子的正常发育是植物延续种群生命和完成进化的前提。人们对植物种子发育相关突变体进行筛选和分析，已鉴定和分离出了一些影响种子发育的基因。这些基因分别或共同控制着种子的种皮，胚乳和胚的发育。基因缺失后，种子各部分的发育可能出现异常：例如胚体发育丧失极性、胚乳分裂速度减缓或增加、种皮无法积累色素导致发育异常等。随着研究的不断深入，许多单基因的表达方式被证明在种子的发育过程中具有特异性。除了单基因对种子发育的调控，不同剂量亲本基因组之间的互作对种子发育也有影响。在孟德尔定律中，来自父本和母本的等位基因对有性生殖产生合子体的发育过程起到同等重要的作用。但早期以玉米作为实验材料发现，来自父本或母本的基因组在种子发育早期阶段的作用不是等同的。几年之后，这一点在拟南芥种子中也得到证实ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Lin</Author><Year>1984</Year><RecNum>72</RecNum><DisplayText>(Lin,1984;Scottetal.,1998)</DisplayText><record><rec-number>72</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">72</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Lin,B.Y.</author></authors></contributors><titles><title>Ploidybarriertoendospermdevelopmentinmaize</title><secondary-title>Genetics</secondary-title></titles><periodical><full-title>Genetics</full-title></periodical><pages>103-115</pages><volume>107</volume><number>1</number><dates><year>1984</year></dates><isbn>0016-6731</isbn><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Scott</Author><Year>1998</Year><RecNum>21</RecNum><record><rec-number>21</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">21</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Scott,R.J.</author><author>Spielman,M.</author><author>Bailey,J.</author><author>Dickinson,H.G.</author></authors></contributors><titles><title>Parent-of-origineffectsonseeddevelopmentinArabidopsisthaliana</title><secondary-title>Development</secondary-title></titles><periodical><full-title>Development</full-title></periodical><pages>3329-3341</pages><volume>125</volume><number>17</number><dates><year>1998</year></dates><isbn>0950-1991</isbn><urls><related-urls><url>/content/125/17/3329.full.pdf</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(Lin,1984;Scottetal.,1998)。此后，许多基因的作用方式被发现具有亲源效应（parent-of-origineffect），即相同的等位基因由于父母本来源不同而在子代中有不同的表达ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Gehring</Author><Year>2011</Year><RecNum>83</RecNum><DisplayText>(Gehringetal.,2011)</DisplayText><record><rec-number>83</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">83</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Gehring,M.</author><author>Missirian,V.</author><author>Henikoff,S.</author></authors></contributors><titles><title>Genomicanalysisofparent-of-originallelicexpressioninArabidopsisthalianaseeds</title><secondary-title>PLoSOne</secondary-title></titles><periodical><full-title>PLoSOne</full-title></periodical><pages>e23687</pages><volume>6</volume><number>8</number><dates><year>2011</year></dates><isbn>1932-6203</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(Gehringetal.,2011)。这些基因受到表观调控（epigeneticprocess）。表观调控包括DNA甲基化/去甲基化，组蛋白甲基化/去甲基化和组蛋白乙酰化/去乙酰化。表观调控产生的结果是：它们影响基因的表达时间和表达部位但是不影响基因的本来序列ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Adamsetal.,2000;Grossniklausetal.,2001;Gehringetal.,2004)。父本和母本染色体组之间复杂的互作，涉及到表观调控下的多基因的表达量变化ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Grossniklausetal.,2001;Gehringetal.,2004;Gehringetal.,2011;Hsiehetal.,2011;Ikeda,2012;JiangandKöhler,2012)。由于表观调控的复杂和重要性，这使得种子发育的表观遗传调控研究迅速成为当今生殖生物学热点研究领域之一ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Ikeda</Author><Year>2012</Year><RecNum>96</RecNum><DisplayText>(Ikeda,2012)</DisplayText><record><rec-number>96</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">96</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Ikeda,Y.</author></authors></contributors><titles><title>Plantimprintedgenesidentifiedbygenome-wideapproachesandtheirregulatorymechanisms</title><secondary-title>PlantandCellPhysiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>PlantandCellPhysiology</full-title></periodical><pages>809-816</pages><volume>53</volume><number>5</number><dates><year>2012</year></dates><isbn>0032-0781</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(Ikeda,2012)。1.2.1种子发育的调控基因种子的发育涉及到一系列基因的时空特异性表达和相互作用。在模式植物拟南芥中，人们对影响胚发育、胚乳发育和种皮发育的突变体进行筛选和分析，已鉴定和分离了一些影响胚，胚乳和种皮形态建成的主要基因。胚发育的调控基因调控胚生长发育的基因包括调控胚胎极性建立过程的基因和调控后期形态建成过程中的基因，例如:EMB30/GNOM、SHORTSUSPENSOR（SSP）、LEAFYCOTYLEDON2（LEC2）、WUS、FACKEL（FK）和SHB1（SHORTHYPCOTYLUNDERBLUELIGHT1）等ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Shevelletal.,1994;Hecketal.,1995;Lauxetal.,1996;Schricketal.,2000;SantosMendozaetal.,2005;Portereikoetal.,2006;Steffenetal.,2008;Bayeretal.,2009a;Zhouetal.,2009;Klimaszewskaetal.,2010;沈秀平etal.,2012)。EMB30编码的产物属于鸟嘌呤核苷酸交换因子，它作用于小G蛋白ARF-GDP/ARF-GTP之间的转化。缺失突变体打破了受精卵的第一次分裂的不对称性，丧失了顶端-基部极性（apical-basalpolarity），导致胚无法发育。SSP蛋白的父本特异表达对胚柄的延长是必须的，变短的胚柄导致胚致死。LEC2编码一个的转录调控因子。LEC2结合到植物所特有的DNA结合基序B3区域，启动胚的正常发育。WUS是拟南芥胚分生组织形成中一个重要的调控基因。在WUS突变体胚发育中,分生组织发育受到抑制，结果是产生缺失胚顶端分生组织无法产生子叶的胚。FK基因的产物是一种固醇还原酶，参与脂类生物合成。该基因突变导致胚细胞的分裂和扩张生长受阻，产生无下胚轴的胚。SHB1作为光信号通路因子对胚体的作用也是首次被发现。SHB1编码一个蓝光受体，在胚的发育中控制胚细胞分裂的数目而非大小。SHB1突变导致胚体积减小，过表达导致胚变大。胚乳发育的调控基因调控胚乳生长发育的基因包括TITAN（TTN）家族成员，FERTILIZATION-INDEPENDENTSEED（FIS）家族基因成员（FIS1,FIS2,FIS3），PHERES1（PHE1），FORMINHOMOLOG5（FH5），ENDOSPERMDEFECTIVE1（EDE1），AGAMOUS-Like62（AGL62），AGAMOUS-Like80（AGL80），HAIKU家族基因成员（IKU1,IKU2）和MINISEED3（MINI3）等ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Garciaetal.,2003;Ingouffetal.,2005;Luoetal.,2005;Portereikoetal.,2006;Hehenbergeretal.,2012)，TTN家族蛋白大多编码染色质黏连蛋白，其中TTN1编码一个微管作用因子，TTN1突变导致胚乳中产生巨大的多倍性的核，可能与微管的动态组装失败有关ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Tzafrir</Author><Year>2002</Year><RecNum>364</RecNum><DisplayText>(Tzafriretal.,2002)</DisplayText><record><rec-number>364</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">364</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Tzafrir,Iris</author><author>McElver,JohnA</author><author>Liu,Chun-ming</author><author>Yang,LiJun</author><author>Wu,JiaQian</author><author>Martinez,Audrey</author><author>Patton,DavidA</author><author>Meinke,DavidW</author></authors></contributors><titles><title>DiversityofTITANfunctionsinArabidopsisseeddevelopment</title><secondary-title>Plantphysiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>Plantphysiology</full-title></periodical><pages>38-51</pages><volume>128</volume><number>1</number><dates><year>2002</year></dates><isbn>0032-0889</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(Tzafriretal.,2002)。除此之外，一些微丝微管相关蛋白基因突变后也导致胚乳发育的异常。例如FH5，EDE1的突变体胚乳发育均异常。FH5的突变体CZE胚乳发育异常并出现多核聚集现象ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Ingouffetal.,2005;Luoetal.,2005)。EDE1的突变体的NCD周围微管遭到破坏，导致胚乳发育异常。FIS1/MEDEA、FIS2和FIS3/FIE（FERTILIZATION-INDEPENDENTENDOSPERM）基因产物均在胚乳中表达，其突变体均能在未受精的情况下自主开始胚乳核的分裂。在受精之后，突变体出现细胞化延迟或不发生细胞化的现象ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Grossniklausetal.,1998;Luoetal.,2000;Yadegarietal.,2000;Grossniklausetal.,2001;Luoetal.,2005;Barouxetal.,2006;Hsiehetal.,2011)。PHE1是一个在胚乳中父本特异表达的基因。虽然突变体未发现表型，但PHE1突变体可以恢复FIS1突变带来的胚乳细胞化发生延迟的表型，说明两者是有相互作用的ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Kohleretal.,2005)。AGL62（AGAMOUS-Like62）是一个转录因子，编码一个Ⅰ型MADS-BOX功能域蛋白ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Kang</Author><Year>2008</Year><RecNum>225</RecNum><DisplayText>(Kangetal.,2008)</DisplayText><record><rec-number>225</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">225</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Kang,I.H.</author><author>Steffen,J.G.</author><author>Portereiko,M.F.</author><author>Lloyd,A.</author><author>Drews,G.N.</author></authors></contributors><titles><title>TheAGL62MADSdomainproteinregulatescellularizationduringendospermdevelopmentinArabidopsis</title><secondary-title>ThePlantCellOnline</secondary-title></titles><periodical><full-title>ThePlantCellOnline</full-title></periodical><pages>635-647</pages><volume>20</volume><number>3</number><dates><year>2008</year></dates><isbn>1040-4651</isbn><urls><related-urls><url>/content/20/3/635.full.pdf#page=1&view=FitH</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(Kangetal.,2008)。在种子发育过程中，AGL62在合胞体胚乳中高表达，在胚乳发生细胞化之前表达量迅速下降，这说明AGL62抑制细胞化的起始。在AGL62突变体种子中，胚乳细胞化提前。拟南芥AGL80（AGAMOUS-Like80）基因是中央细胞和胚乳发育所必需的一个基因ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Portereiko</Author><Year>2006</Year><RecNum>355</RecNum><DisplayText>(Portereikoetal.,2006)</DisplayText><record><rec-number>355</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">355</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Portereiko,MichaelF</author><author>Lloyd,Alan</author><author>Steffen,JoshuaG</author><author>Punwani,JaysonA</author><author>Otsuga,Denichiro</author><author>Drews,GaryN</author></authors></contributors><titles><title>AGL80isrequiredforcentralcellandendospermdevelopmentinArabidopsis</title><secondary-title>ThePlantCellOnline</secondary-title></titles><periodical><full-title>ThePlantCellOnline</full-title></periodical><pages>1862-1872</pages><volume>18</volume><number>8</number><dates><year>2006</year></dates><isbn>1040-4651</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(Portereikoetal.,2006)。AGL80也在中央细胞和胚乳发育的早期表达。AGL62和AGL80在中央细胞的发育过程中相互作用，有可能形成异源二聚体共同保证中央细胞的正常发育。同时，又有证据表明AGL62在细胞化起始方面的作用是受FIS家族基因成员FIS2的直接或间接调控的。除此之外，影响胚乳发育的调控基因还包括HAIKU（IKU）家族成员。这类基因包含IKU1,IKU2。IKU2编码一类受体激酶，在IKU2突变体中，种子变小，胚乳细胞化提前。MINISEED3是一类WRKY转录因子，名为WRKY10/MINISEED3（MINI3）（Garciaetal.,2003;Luoetal.,2005）。在MINI3突变体中，种子变小，胚乳细胞化提前。有证据表明MINI3和IKU2突变体具有类似的表型，在胚乳发育调控上存在相互作用ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Luo</Author><Year>2005</Year><RecNum>54</RecNum><Display