专题五1DNA粗提取与鉴定

DNA的粗提取与鉴定1.实验原理1.DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质那么可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。3.DNA遇二苯胺〔沸水浴〕会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。2.实验材料和用具实验材料：1、鸡血细胞液〔5~10ml〕；2、体积分数为95%的冷酒精溶液〔实验前置于冰箱内冷却24h〕；3、蒸馏水；4、质量浓度为0．１g/ml的柠檬酸钠溶液；〔抗凝剂〕5、物质的量浓度分别为2mol/L和0．015mol/L的NaCl溶液；6、二苯胺试剂。3.实验用具：铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒〔100ml，一个〕；烧杯；〔100ml，一个，50ml、500ml各二个〕；试管〔20ml，二个〕；漏斗；试管夹；纱布。4.5.8、DNA的鉴定①DNA与二苯胺〔沸水浴〕会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂②紫外灯照射法A、配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的溴化已锭〔EB〕B、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴EB溶液染色C、将蜡纸放在紫外灯(260nm)下照射〔暗室中〕，可见橙红色的荧光(DNA的紫外吸收顶峰在260nm处)③甲基绿〔蓝绿色〕6.二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计〔一〕实验材料的选取材料：新鲜的鸡血注意：本实验中，要往鸡血中参加抗凝剂〔柠檬酸钠溶液〕原那么上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。7.(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞(2)在鸡血细胞中参加一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可〔二〕破碎细胞，获取含DNA的滤液1、破碎细胞讨论：为什么参加蒸馏水能使鸡血细胞破裂？利用了什么原理？2、过滤，获取含DNA的滤液8.讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质9.讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA别离方案二利用了酶的专一性；方案三利用了DNA的稳定性。10.〔四〕DNA的析出与鉴定DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液〔体积分数为95％〕，静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水1、DNA的析出11.12.2、DNA的鉴定鉴定DNA时在试管中先参加物质的量的浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只参加DNA丝状物，各参加二苯胺4ml试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色13.〔一〕案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例②鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长1、鸡血细胞做实验材料的原因①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得14.2、实验原理①DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。③DNA遇二苯胺〔沸水浴〕会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。15.4、课前准备鸡血细胞液取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液〔抗凝剂〕100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血〔约180ml〕，同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。〔也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min〔转每分〕的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。〕①过程16.②柠檬酸钠作用防止血液凝固③作用机理柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反响，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液就不会凝固鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液④本卷须知17.讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？答：血液分为两局部，一局部是血浆，一局部是血细胞，离心后除去的上清液是血浆5、方法步骤将制备好的鸡血细胞液5mL～10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中参加蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。①提取鸡血细胞的细胞核物质18.19.讨论：答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破〔1〕为什么要参加蒸馏水？参加蒸馏水后细胞会有什么变化？〔2〕用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA〔3〕滤去的是什么物质？得到的是什么？答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA20.②溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为2mol的溶40mL参加到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态沿烧杯内壁缓缓参加蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续参加蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止参加蒸馏水〔这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14mol／L〕③析出含DNA的粘稠物21.22.讨论：参加蒸馏水的目的？降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出将溶液中的DNA与其他杂质别离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁参加蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕本卷须知：23.④滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上⑤将DNA的粘稠物再溶解取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol／L的溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中24.25.⑥过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中⑦提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，参加冷却的、酒精的体积分数为95％的溶液50mL〔使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳〕，并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA26.27.答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中讨论：〔2〕观察丝状物呈什么颜色？答：白色〔1〕为什么要加50mL的冷酒精？28.取两支20mL的试管，各参加氯化钠的物质的量浓度为0．015mol／L的溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各参加4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化⑧DNA的鉴定29.30.讨论：答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色〔2〕这一鉴定结果说明什么问题？〔1〕比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？答：提取出的丝状物是DNA〔3〕DNA的直径约为20×10-10m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？答：DNA分子直径只有2nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的31.32.答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌〞6、讨论：①两次蒸馏水第一次：细胞吸水胀破第一步第二次：使DNA黏稠物析出第三步〔1〕此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？33.过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为1－2层②三次过滤第一次：DNA存在于滤液里第一步第二次：DNA被留在纱布上第四步第三次：DNA存在于滤液里第六步34.③两次析出第一次：用0.14mol／L的NaCI溶液含杂质多第三步第二次：用冷却的95％的酒精第七步④六次搅拌：第一、二、三、五、七步其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA35.〔2〕为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质36.1、在制备鸡血细胞液的过程中，参加柠檬酸钠的目的是〔〕A.防止凝血B.加快DNA析出C.加快DNA溶解D.加速凝血练一练A37.2、DNA的溶解度最低时，NaCl的物质的量浓度为〔〕A2mol/lB0.1mol/lC0.14mol/lD0.015mol/l3、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断参加蒸馏水的目的是〔〕A加快DNA溶解的速度B加快溶解杂质的速度C减小DNA的溶解度，加快DNA析出D减小杂质的溶解度，加快杂质的析出CC38.4、向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中不断参加蒸馏水,在这个过程中DNA的溶解度变化情况分别是A减小;减小B增大;增大C先减小后增大D增大;减小5、欲使溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中的DNA析出，最有效的方法是A加蒸馏水B加矿泉水C加清水D加生理盐水39.6、与析出DNA粘稠物有关的表达，不正确的选项是A操作时缓慢滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度B操作时用玻棒轻缓搅拌以保证DNA分子的完整C加蒸馏水可以同时降低DNA和蛋白质的溶解度D当丝状粘稠物不再增加时，NaCl溶液的浓度可以认为是0.14mol/L7、你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗？用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。40.8、DNA遇二苯胺会染成〔沸水浴〕A硅红色B红色C紫色D蓝色D41.〔二〕案例二：以菜花为实验材料进行DNA的粗提取1、课前准备将新鲜菜花和体积分数为95％的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24h2、提取DNA的具体步骤①取材：称取30g菜花，去梗取花，切碎②研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min42.研磨液的配制方法如下：将10.1gTris加入到50mL蒸馏水中，使其溶解，然后，用2moL/L的HCl溶液调节pH至8.0，再加入8.76gNaCl、37.2gEDTA、20gSDS。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至1000mLTris/HCl:提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态（Tris为三羟甲