DB43-T 2816-2023鱼类粘孢子虫检测方法地方标准

ICS65.020.3043CCSB4443湖 南 省 地 方 标 准DB43/T2816—2023鱼类粘孢子虫检测方法Detectionmethodsoffishmyxosporean20232023110920240209湖南省市场监督管理局发布目 次前言 II范围 1规性用1术和1试与1仪与1采样 2检步骤 2结判定 3附录A（规性）剂其4附录B（资性）同孢虫染及包形态 5附录C（资性）种见孢虫孢子6前 言GB/T1.1—20201请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。究所。本文件主要起草人：刘新华、任诗思、皮杰、李德亮、向建国、余建波、吕欣荣、刘志辉、叶少文。鱼类粘孢子虫检测方法范围文件。SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范SC/T7223.11SC/T7223.22SC/T7223.33SC/T7223.44SN/T2503淡水鱼中寄生虫检疫技术规范3术语和定义3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4试剂与材料本标准所使用的试剂均为分析纯，水为蒸馏水。乙醇：7010xPCRBufferMIX：-20上游引物：5’-GATTGACGAGGTCGTTCGTTTA-3’；下游引物：5’-AGTAGGCCCTTACCCTACTTAC-3’；rRNA（18SrDNA）DNAmarker2000（bp）:2000、1000、750、500、250、100。5仪器与设备解剖盘、剪刀、镊子、解剖针、解剖刀。体视显微镜和带测微标尺的光学显微镜。盖玻片、载玻片、培养皿、巴氏吸管。恒温水浴锅（控温范围：RT-100℃±1℃）。-2080（0.5μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000PCR离心管和PCR采样样品的采集应符合SC/T7103、SC/T7223.1、SC/T7223.2、SC/T7223.3和SC/T7223.4中的相关要求，样品封存和运输应符合SC/T7103的相关规定。目检SN/T2503镜检7.120-30μL等）20-306.270%（附录A）DNA将6.2固定的样品充分混匀，破碎后用磷酸盐缓冲液洗涤两次以去除残余酒精。将离心管置于-80℃5min805min/DNADNA20PCR在50μL的PCR反应体系中，包含模板基因组DNA2μL、10×PCRBufferMIX（康为世纪）25μL、上游引物和下游引物（10μM/L）各2μL、加双蒸水定容至50μL。PCR94411min,3510min。PCR扩增时，应设置阴性对照和阳性对照。PCR5PCR1.0TAE（DNA900bp在，则取PCRGenBankBLAST目检当肉眼观察到明显白色包囊或白色囊状物（见附录B），可以怀疑为粘孢子虫感染，但需经8.2、8.3步骤检查后才能进一步确诊。镜检8.2.28.18.2.1C）分子鉴定8.2.28.18.2.1C）分子鉴定18SrDNA（900bpGenBank80%附录A（）70%70mL无水乙醇溶液，加30mLPBS缓冲液（0.01mol/L,pH7.4）。（0.01mol/L,pH7.4）7.9gNaCl，0.2gKCl，0.24gKH2PO4（or1.44gNa2HPO4）1.8gK2HPO4800mlHClpH7.41L，4TAE（50）242.0gTris37.2gNa2EDTA·2H2O800mL57.1ml1L取溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL,在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后加双蒸水定容至50mL，加入氢氧化钠（NaOH）溶液1滴，调至蓝色。附录B（资料性）不同粘孢子虫感染症状及包囊形态图B.1不同粘孢子虫病感染症状(A)图B.1不同粘孢子虫病感染症状(A)1cm；(B)5cm；(C)5cm；(D)5mm；(E)：汪氏单极虫感染异育银鲫鳃症状，靶尺=0.5cm；(F)：