DB43-T 2812-2023 普通丝瓜杂交种纯度鉴定SSR法技术规程

ICS

67.080.20CCS

B31

43

Code

DB

43/T

2812—2023 前言

II1 范围

12 规范性引用文件

13 原理

14 主要仪器设备、试剂耗材

15 试剂配制

26 引物

27 鉴定流程

28 纯度计算

3附录

A（资料性）

5附录

B（资料性）

7DB

43/T

2812—2023 本文件按照GB/T

1.1—2020

第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。学研究院，湖南湘妹子农业科技有限公司。本文件起草人：韩小霞、胡新军、闵子扬、李勇奇、邓稳桥、卢亚楠、刘昆言、粟建文。IIDB

43/T

2812—2023

1 范围计算。本文件适用于普通丝瓜杂交种纯度鉴定。2 规范性引用文件文件。GB/T

3543.2

农作物种子检验规程

扦样3原理SSR标记技术是一种以特异引物扩增为基础的分子标记技术。由于SSR标记广泛存在于植物基因片段电泳谱带的差异，可鉴定杂交种纯度。4主要仪器设备、试剂耗材主要仪器设备0.001片观察灯、数码相机、4

℃冰箱和

-20

℃冰箱。主要试剂Ethylenediaminetetraacetic

acid

disodium

，EDTA-2Na

）、盐酸（）、氢氧化钠（NaOH）、三羟甲基氨基甲烷【Tris(hydroxymethyl)

methyl

，Tris）】、三氯甲烷(Chloroform)Sodium

sulfonate，Isoamyl

alcoholTaq

聚合酶、dNTP

(dATP、、dGTP、dTTP)、引物、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉双丙烯酰胺（N，N，

-methyleme

bisacrylamideTEMEDBoric

Ammonium

persulfateSilver

nitrate冰醋酸（Glacial

acetic

acidSodium

acetate）、甲醛（Formaldehyde）、水（H2O）符合GB-T

6682-2016规定。主要耗材离心管（

ml、

ml、2.0

ml孔板、96孔PCR扩增板、96孔PCR扩增板管盖、量筒、发芽盒、玻璃板、玻璃棒、一次性手套、一次性口罩。DB

43/T

2812—20235 试剂配制相关试剂配制方法见附录A6 引物部分SSR引物信息见附录B7 鉴定流程种子催芽种子扦样参考GB/T

3543.2250102830芽至种子露出子叶。取样取发芽种子胚轴

cm～1

cm，用于DNA.DNA

可采用CTAB小样法或者快速碱煮法提取。7.3.1 CTAB

小样法

DNA2

ml上放置或者放冰箱冷冻。将研磨好的样品放置于48孔板架上，60

℃水浴30

，中间每隔5

min摇一次，使样品受热均匀。2

mL

0.8

mL氯仿:5

cm～10

min后10,000

5

2

mL离心管，

1室温静置3

min，5,000

5

min

用的乙醇洗涤沉淀2入

µL

60

ddH2O，再加入5

µL

RNaseA(10

µg/µl)，37

℃温浴10

，最后加入1/10的3

mol/L

NaAc及2

℃放置20

min。

5,000

rpm离心5

70%的乙醇洗涤沉淀2次，风干乙醇后加入200

µL

ddH2O。用紫外分光光度计检测DNA浓度并将DNA溶液用ddH2O稀释到20

ng/µL，

℃冰箱中保存备用。7.3.2快速碱煮法将丝瓜胚轴放入96孔0.25

mol/L的NaOH溶液50

µL96孔板盖盖好PCR板，置于沸水中煮3

，最后加入0.1

mol/L的Tris﹒

(pH=8.0)

150

µL。PCR

7.4.1 扩增体系DNA模板约

µL，10×Buffer

1

µL，10

mmol/l

dNTP

0.1

µL，10

pmol/l

0.2

µL，2.5U/µl

rTaq

µL，加灭菌ddH2O10

µL。7.4.2 反应程序

𝑁𝑁1 ×100%···································································DB

𝑁𝑁1 ×100%···································································94

℃预变性4

，94

℃变性

s，58

℃退火30

s，72

℃延伸30

s，共3072

伸5

min，4℃保存。电泳检测PCR结束后，在每孔中加入2

µL

64

℃冰箱待检测。对于扩增条带大小差别不大的扩增产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，扩增条带大小差别较大的扩增产物宜采用普通琼脂糖凝胶电泳。7.5.1 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳装置准备中，将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪连接。 灌胶将现配的8

%丙烯酰胺（）凝胶，轻轻摇匀，缓缓灌入玻璃胶室，胶灌满整个胶室后，插入样品梳，室温下聚合90

min。胶完全聚合后，加入0.5×TBE 点样与电泳检测每个PCR扩增产物中加2

µL

63

µL样品，并设置标准分子量

V恒压电泳90

min左右。 染色、显色和拍照500

ml蒸馏水清洗233

～5

2次～3次。将胶板放入盛有400

mL显影液的托盘中，轻轻摇动至条带清晰后，迅速用蒸馏水漂洗3遍～5遍，将胶用保鲜膜包好，置于胶片观察灯上，观察带型并拍照记录。7.5.2 普通琼脂糖凝胶电泳将PCR产物与2

µL

6×加样缓冲液混合，点样至

%～3.0

%的琼脂糖凝胶点样孔内（含有µg/mlDNA1×TAE缓冲液中进行凝胶电泳，电泳电压

V，电泳时间约30

min扩增条带。8 纯度计算SSR扩增条带表现双亲带型，则为杂交种；表现任一亲本带型或者其他带型，则为假杂种。分别统计杂交种和假杂种的样品数量，根据式计算杂交种纯度。𝑃𝑃

=

𝑁𝑁1−𝑁𝑁2式中：𝑃𝑃——代表杂交种纯度𝑁𝑁1——𝑁𝑁2——代表非杂交种谱带类型的个体数量DB

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2812—2023DB

43/T

2812—2023

附 录

A（资料性）常用试剂配方A.1DNA

A.1.10.5

mol/L

EDTApH

）溶液称EDTA

186.1

g，加入已有

ml双蒸水的烧杯中，用氢氧化钠调节pH8.0，补双蒸水至1000ml

ml

20

min4

℃冰箱中保存备用。A.1.2 1

mol/L

Tris-HCl（三羟基氨基甲烷盐酸，pH

8.0）溶液称121.1

g

Tris加入含有

ml双蒸水的烧杯中，用盐酸调节pH值至1

L，摇匀，4

℃冰箱中保存备用。A.1.3 DNA

提取液取1

mol/L

Tris-HCl溶液50

、0.5

mol/L

20

，称SDS

7.5

g和氯化钠

g加入到500

ml烧杯中，用双蒸水定容至

ml，充分混匀，使得溶液中的最终浓度为Tris•HCl

100

mmol/L，EDTA

mMol/L，NaCl

mmol/L，

1.5

%（A.1.4 氯仿:异戊醇:乙醇（）取

ml三氯甲烷，8

ml异戊醇和32

乙醇加在一起混匀，4

℃冰箱保存备用。A.1.5 0.25

mol/L的

称取NaOH

，加入双蒸水定容至

ml。A.1.6 0.1

mol/L的Tris﹒取1

mol/L

Tris-HCl（pH

8.0）10

100

ml。A.2 PCR

PCR扩增所用的，

DNA

℃100

µM10

µl加90

µl10

µM的工作液，

A.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂A.3.1 10×TBE

缓冲液称取108

g

Tris，55

g硼酸，40

0.5

M

EDTA

8.0)1

L，摇匀。A.3.2 10

%（）称

g过硫酸铵，加入1

ml双蒸水，混匀，现配现用（保质期48

h）。DB

43/T

2812—2023A.3.31×TBE

缓冲液取

缓冲液200

ml，加双蒸水1800

A.3.4 1×TAE

缓冲液取

缓冲液200

ml，加双蒸水1800

A.3.5 6称取溴酚蓝0.25

g，二甲苯青0.25

g98

2

ml

EDTA（pH

）溶液溶解，混匀，-20

A.3.6 8%

PAGE（丙烯酰胺）凝胶40

%

PAGE

8

ml、

4

、ddH20

28

ml、10

%

AP

µl、TEMED

20

µl40

ml，实践中可根据垂直板的大小按比例配置凝胶。A.4 银染、显影试剂A.4.1 染色液称

g硝酸银，加双蒸水1000

ml溶解，再加

ml甲醛混匀。A.4.2 显影液称15

g氢氧化钠，加入1000

双蒸水溶解，再加

ml5'-3'3'-5'S01CTCCCTCTTTCCCTCACTCCGACAGGACCGTTAACCCAAAS02TAAATACCCGCCTCGAACACTCCATCCCAGATTTTGCTTCS03GGGAGAACAAGATAGCCCAATGCAAACTTCGATTTGCTCAS04CAGCTCTACAACAACATCTCATCATTGGATGTGGGATTCTCS05AAGATTGAAGTGGGAAAATGCGGCAATCATCTTATCTTTCS06TGGAGTGTTGACATTGTTTTCAGGTTGGAGTAAGCCAAATTACAS07TTGAAGATGAAGCCGGAGTTCTAGAGTCAGATGCCTCGCCS08AGAATAAGGTCCACATAAGGGTTAAAGGCTATGGTATAGAACS09CAGCTCTACAACAACATCTCATCCAACTCGACCAAGAAACS10ACTCAATCCAACCCACGAATAGTGGCATTTGAACGCTAAGTTGS11TTCGCCTCAGTCCATCTAGTTTATGTCGTACCTTTTCCCCTTTTS12TTTGAATCTCGCCATGAAGCTACCCTGTTTTGCAGCTACGS13CTCCTCAAGAAAATCCACTTCCCCAGGTAATTCTCCTCCATGTCS14TATTGCCCCAAACTCTTCTCTCATGGACAAAACTTCATAACGCCS15TTCGCCTCAGTCCATCTAGTTTATGTCGTACCTTTTCCCCTTTTS16TTCCCCATCCATACATTTCTTCCCCTCTCTTCTCCATTTTCTCAS17GGCGGAATACAAGAAAGATACCCATGTGAAAAGGGAACAGAGAAS18CCAACTATCACCCCTACAATCAGGACAGAACCTAAAAGAAAGAAGAGS19GTCTTCCTGAGAGCTTTTGCATCCCTCTTCTCCTTCGATCTTCTS20AACCTCTCGTCATTACTACCGCGTGACTAAAAGCGTGTGAGTGGS21CGTTTGAGATGTGTGCATGTAGTTAAGAGACTGGTTGGAGTTGAGAS22TACCTTCACCCAACTCGCTATTGTGTGTGTTTGATCGGCTGTTS23TTTGTTCTATTCCCCTCTTCCATCGATTACGACGACTTTCTTGAS24TCAGGAAGTGGAGACAACACCGGGAAAAGACTGCACCATCAS25GCTCTCGATTCTAACCAAAACCTCATTCTACCTCTCCAATTCCAS26ACATTTTCACTAGCAGAAGGGGGTGCCCATGTATAGGAAGCAAS27GAAAGAAGGCGAGGAGTGTAGAGAAAAGGAAAGTTGGGGTGTTTS28TTTGGGCTCTGACATTAGATGAACACCTTTGGGAGATAACAAGCS29CTCCAAGGAAGAAGAAGAAACCAATACTGCCACATCATCAGCTCS30GGAGGAGGGAAGAGGAGATGAGGTAAAGCAACAACCCCATAAS31GTCGCCACCGTTGAGTTTAACCTTAATCCGGCTAGGAAAGDB

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2812—2023

附 录

B（资料性）引物信息表

）公布的信息。表表

引物信息5'-3'3'-5'S32CATCACCACCACCACAACCGCCACCAAAATCAGCTCTATGS33AGAAGTGGGAGATTGAACATGCGTTGGTATGTGAACCTTGAGGCS34TCCACCAACTCTCACTTTCCTTGCATATCCCCAAAACGAACTAAS35AAGACAAATTAAGGAGGGGAGGTAAGACGAGCGTAATGGTTGACS36TTCTTTCTCCTTCGCTGTCTTCGGGATGATGATATTCGGAGCTAS37CCACCCCATTTCATACACAATACATTCAACCTAAGAGCGAGTGAS38AATTTTATGGACCTCATTCCCCTTTA