益气软坚散结法对甲状腺功能减退大鼠心肌r1rna表达的影响

益气软坚散结法对甲状腺功能减退大鼠心肌r1rna表达的影响

减少甲状腺功能是指由于甲状腺激素的合成和分泌减少或组织使用不足引起的全身代谢障碍。甲减与心肌损伤密切相关。甲减心脏损害最早由Zondez于1918年报道,目前认为70%～80%甲减患者有心血管病变,甲减致心肌损伤和心功能不全的机制复杂,但与血清T3对心脏功能的调节作用密切相关。甲减可以减少血容量,降低心脏舒张功能,增加外周血管阻力,降低心肌收缩力,减慢心率,从而减少心输出量,使心脏代偿性增大。血清T3通过与心肌细胞内甲状腺激素核受体(TRs)结合发挥对心肌细胞的作用,TRs有3个主要亚型即TRα1,α2,β1。其中TRα1较其他亚型与T3的亲和力高,而TRα1在机体内的分布主要以心肌为主,我们前期研究发现单纯中药可以明显提高甲减大鼠血清T3水平,机制不清楚,该法对甲减心肌损伤的改善是否与提高TRα1表达有关未见报告。因此,进一步证实中医治法对甲减致心肌损伤的修复作用及对甲减大鼠心肌TRα1mRNA表达的提高具有重要的意义。本实验运用低碘饲料和高氯酸钠复制甲状腺功能减退致脏器损伤的动物模型,用酶联免疫吸附测定法(Elisa法)测血清TSH,放射免疫分析法(RIA)测血清TT3,TT4。实时荧光定量PCR(Real-timePCR法)检测大鼠心肌TRα1mRNA的表达。来证实益气软坚散结组能对甲状腺功能和心肌TRα1mRNA的表达及心肌形态有恢复作用。此为中药防治甲减心肌损伤机制提供科学依据。1材料和方法1.1动物分组、模型构建甲减动物造模方法参照Kolaja法制作,选用4周龄的Wistar大鼠(90～120g),雌雄各半,饲以实验专用的低碘饲料(其含碘量为20μg/kg),同时喂1%高氯酸钠19天停用,续喂双蒸馏水2天(计21天),随机分4组,每组30只。正常组:普通饲料,双蒸水。模型组:低碘饲料,双蒸水。L-T4组:低碘饲料,每日灌服2mL的L-T4混悬液,L-T4含量约为9.45μg/kg,并灌服2mL的双蒸水。益气软坚散结组:低碘饲料,灌服2mL含生药量约为18.9g/kg的芪贝复元饮,并灌服2mL的双蒸水。动物处死时间和数量:分别在给处理因素后的0天、56天处死动物,每组每次相应处死10只动物。1.2乌拉坦血清学测定处死前一天,将大鼠放入代谢笼中,留24h空腹尿,取3～5mL放入5mL的eppendorf管中,保存在-20℃冰箱中。处死前,称体重,20%乌拉坦腹腔麻醉,腹主动脉取血,分离血清,存入1.5mLeppendorf管中,保存在-20℃冰箱中。腹主动脉采血后,迅速准确取出心脏置于Trizol固定液中,-70℃冰柜保存。1.3elisa试剂盒大鼠血清促甲状腺激素(TSH)测定用酶联免疫吸附测定法(Elisa法),美国Rapidbio(RB)公司ELISA试剂盒。血清总T3(TT3),总T4(TT4)测定用放射免疫分析法(RIA),试剂盒由北京赛博润特科技发展中心提供。1.4尿碘测定采用中华人民共和国卫生部行业标准规定的方法。砷铈催化分光光度法测定尿碘。1.5采用real-timepcr法检测大鼠心肌tr1mna的发现变化1.5.1仪器、实验设备荧光定量PCR试剂盒,cDNA合成试剂盒(由大连宝生物提供),PCR扩增仪(德国Biometra),ABI7500扩增仪、DK-8B型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司),小型台式离心机(美国SIGMA,1-13),高速冷冻离心机sigma31k5C型(美国),紫外分光光度计(英国UV-visibleSpectrometer,UV300)。1.5.2操作步骤(1)rna的紫外分光光度计检测取组织100mg,用TRIzol试剂(GIBCO公司)按试剂盒所述方法提取总RNA,采用紫外可见光分光光度计测定260nm、280nmOD值,样品-70℃保存备用。取1μLRNA样本,加79μLDEPC水,用紫外分光光度计测RNA浓度和纯度。取2μg总RNA利用逆转录系统(Promega公司)逆转为cDNA,-20℃保存。(2)变性20sPCR反应条件:95℃预变性5min;93℃变性30s;55℃复性30s,72℃延伸30s,共40个循环;72℃延伸10min。1.5%琼脂糖电泳鉴定PCR结果。(3)实际pcr的常数使用荧光定量PCR试剂盒由大连宝生物提供,按照试剂盒说明研究TRα1mRNA在心肌细胞上的阳性分布及定位。(4)pcr固定溶解曲线的定量测量荧光定量PCR试剂盒由大连宝生物。定量PCR程序为95℃5min;95℃15s;63℃40s,40个循环。1.6光下心肌形态的观察常规HE染色,光镜下观察心肌细胞形态改变。1.7检验t检验尿碘值用尿碘中位数表示,其余数值用(x¯±sx¯±s)表示。两个样本均数比较用t检验,两个以上样本均数比较用方差分析。P<0.05为有统计学意义。数据用SPSS17.0软件包做统计学处理。2结果2.1结果分别为0天和56天见表2。2.2大鼠心脏的绝对和相对重量n.8见表3。2.3采用益气健康散结法对减少甲大鼠的甲状腺功能影响见表4。2.4光学显微镜观察2.4.1小等效质构与心肌纤维(1)正常组:心肌细胞呈圆形或椭圆形,细胞排列紧密,细胞核大小相等,细胞质均匀,心肌纤维连续,致密(见插图Ⅱ图1);(2)模型组:近80%的细胞肿胀变形,部分细胞融合成片,细胞核偏移或消失,细胞质呈空泡样,心肌纤维断裂,稀疏(见插图Ⅱ图2)。2.4.2核酸偏移或消失L-T4组:部分细胞恢复呈椭圆形,排列稀疏,细胞核偏移或消失(见插图Ⅱ图3);芪贝复元饮组:细胞排列较前紧密整齐,部分细胞质空泡样变性消失,心肌纤维较连续(见插图Ⅱ图4)。2.5素描素描(1)如表5所示模型组较正常组心率减慢,电压偏低,说明心脏每搏输出量减少,提示心肌供血不足。(2)处理因素56天芪贝复元组与L-T4组均可以影响甲减大鼠的心功能,改善心肌供血不足的现象,芪贝复元组与L-T4组比较无明显差异。2.6采用益气健康散结法对甲状动脉细胞tr1nmolu的影响2.6.1tr1mna溶解曲线见插图Ⅱ图5。2.6.2对甲减模型大鼠心肌tr1基因表达的影响法计算每个样本中参照基因与目的基因的CT值差异,能衡量基因表达水平,根据TRα1mRNA的溶解曲线,取最佳溶解温度是86℃的CT值,表中示:中药组的TRα1基因表达较西药组高,实验结果表明益气软坚散结法可以使甲减模型大鼠心脏组织中的TRα1基因表达增加,对心肌损伤有一定的恢复作用(见表6)。3合成酶基因trs甲减最严重的并发症就是甲减性心脏病,所谓甲减性心脏病是指甲状腺功能减退的患者伴有心肌改变或心包积液,心脏是甲状腺激素作用的主要靶器官之一。甲减时甲状腺激素不足,FT3、FT4水平降低直接影响心脏收缩功能和舒张功能,致心脏细胞间黏蛋白、黏多糖沉积,导致心肌张力减退,心肌假性肥大,心肌纤维间质黏液性肿胀、变性、坏死,实验结果显示,光学显微镜下可见近80%的细胞肿胀变形,部分细胞融合成片,细胞核偏移或消失,细胞质呈空泡样,心肌纤维断裂,稀疏。甲减时出现心脏电传导异常,在心电图上的变现为心率减慢,肢体导联低电压等,与文献报道一致。研究发现甲状腺激素对心脏的功能起着重要的调节作用。但要通过与甲状腺激素核受体结合才能发挥对心肌细胞的作用。TRs在各组织器官中广泛分布。其中TRα1在心脏组织中表达最多,而且它与血清T3的亲和力较其他受体异构体强。现代医学对于甲状腺功能减退症的治疗主要是依靠甲状腺激素的替代治疗,往往不能达到治愈的效果,还易诱发心肌缺氧导致心绞痛甚至心梗的发生,所以其不良反应不容忽视。中医对甲减治疗和研究由来已久,中医学虽无“甲状腺功能减退”之病名,但根据其临床症状和体征,一般归属“虚劳”范畴。导师经多年临床研究发现脾气虚弱也是甲减的主要证型。《证治汇补·虚损》亦指出“虚者,血气之空虚也;损者,脏腑之损坏也”。说明重视“后天之本”的重要性。导师