血友病af基因内含子倒位pcr检测法的建立及初步应用

血友病af基因内含子倒位pcr检测法的建立及初步应用

血友病（h）是大多数临床和隐性遗传疾病之一，呈x光刻化。由于FⅧ基因缺陷,患者常自发性或外伤后出血不止,目前尚缺乏有效的根治措施。因此,对HA患者及其家系成员做出准确的基因诊断、携带者筛查,可有效阻断致病基因的进一步传递,实现优生优育,对社会及家庭具有重要意义。HAFⅧ基因定位于Xq28,含26个外显子及25个内含子,突变类型复杂,表现为点突变、插入、缺失、倒位、重排等类型且呈高度异质性。资料表明,内含子22倒位约占重型血友病患者的45%。近年来,国内外学者多运用长链PCR(Longdistance-PCR,LD-PCR)对HA家系中内含子22倒位进行基因诊断的初步筛查。但LD-PCR实验技术要求较高,实验室推广应用有一定困难。亦有文献报道,该法对羊水的扩增未曾取得满意效果。鉴于此,本研究拟建立一种准确、快速的倒位PCR检测方法,并初步应用于血友病A内含子22倒位检测,旨在探讨其对血友病患者、携带者的基因诊断及产前诊断的实际应用价值。现报道如下。材料和方法1pcr检测ha基因表达24个家系均来自于加拿大Queen′sUniversityRichardson实验室DavidLillicrap教授研究组及加拿大血友病诊断中心,标本收集时间为2004年2月～2006年6月,每个家系至少有1例先证者。按国际HA诊断标准,所有先证者均有详细的HA临床诊断证明及治疗追踪调查记录。所有参加HA基因诊断患者均经研究机构伦理委员会批准,并征得所有家系成员同意并签署诊断知情同意书。外周血采用DNA提取试剂盒,分光光度计测定DNA纯度及浓度后分装、-80℃保存备用。1例22内含子倒位携带者在孕18周抽取羊水,常规酚氯法提取羊水细胞DNA,浓度测定及储存同上。2基因外引物及内含子的筛选内含子22、内含子1引物设计参照文献,均由Invitrogen公司合成。内含子22引物序列:上游共用引物IU:5′-CCTTTCA-ACTCCATCTCCAT-3′(Accessionnumber:BX-842559,nt:35744-35763),下游引物ID:5′-ACATACGGTTTAGTCACAAGT-3′(Accessionnumber:BX842559,nt:14622-14602),基因外的下游引物ED:5′-TCCAGTCACTTAGGCTCAG-3′(Accessionnumber:BX682237,nt:15364-15347)。内含子1引物序列:INT19F:5′-GTTGTTGGG-AATGGTTACGG-3′,INT12F:5′-GGCAGGG-ATCTTGTTGGTAAA-3′,INT12R:5′-TGGG-TGATATAAGCTGCTGAGCTA-3′。SRY-F:5′-GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG-3′,SRY-R:5′-CTGTAGCGGTCCCGTTGC-TGCGGTG-3′。Taq酶、BclⅠ酶购自Promega公司、T4Ligase购自Invitrogen公司。BiometraTProfessionalThermocyclerPCR仪,Bio-Rad凝胶电泳装置、Bio-RadGelDoc2000凝胶成像系统,其他均为分子诊断实验室常规设备。3f基因22位倒位检测、随机对照试验和1位内含子的倒位检测3.1酶切f基因片段的扩增和克隆的表达在FⅧ基因内含子22中有2个基因FⅧA和FⅧB,FⅧA转录方向与FⅧ相反,FⅧB与FⅧ相同。X染色体远端另有2个FⅧA同源基因。FⅧA可与2个同源基因之一发生同源重组,从而使FⅧA基因从外显子1～22倒位至X染色体长臂远端,而外显子23～26仍处于原位。结果见图1。研究中应用BclⅠ限制酶酶切FⅧ基因片段,酶切片段包含上述同源序列,酶切DNA产物用T4连接酶自连接成环状,在环状DNA连接点两端设计引物进行PCR扩增。若为野生型,连接点上下游引物IU、ID间序列经PCR扩增可得到487bp片段。若为内含子22倒位,连接点上下游引物IU、ED间序列经PCR扩增可得到559bp片段。若为携带者,则可同时扩增出487、559bp两条片段。3.2pcr检测取上述基因组DNA1～2μg,50μl酶切反应体系中加入BclⅠ限制性内切酶10～20U(10U/μgDNA),补齐三蒸水,于50℃恒温条件下反应4～6h或过夜充分消化。酶切后产物经酚-氯仿(1∶1)抽取2次,继以氯仿-异戊醇(24∶1)抽取1次,以3mol/L醋酸钠及2倍体积预冷乙醇沉淀后,溶解于50μl三蒸水中。酶切产物用T4DNA连接酶连接成环状,连接反应体系600μl:其中含5×缓冲液120μl,上述提取的DNA50μl,T4DNA连接酶3U,双蒸水补齐,在16℃恒温条件下反应20h。连接产物经上述酚-氯仿-异戊醇抽取,醋酸钠及乙醇沉淀后溶解于20μl三蒸水。25μl反应体系中包括10×PCRBuffer2.5μl、2.5mmol/LdNTP2μl、MgCl20.75μl、1U/1D/ED引物各0.75μl、连接产物6μl、Taq酶0.1μl、ddH2O11.4μl。PCR反应条件:94℃2min,继之94℃30s、55℃60s、72℃90s,30个循环,72℃10min,阳性扩增片段为559bp,正常对照片段仅为487bp,携带者为上述2条带。1.0%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,判读结果。对于检测阳性者,抽取患者母亲外周血,提取DNA后按照上述方法对内含子22倒位进行检测。经患者要求,对其中1例内含子22倒位携带者在孕18周抽取羊水,常规酚氯法提取羊水细胞DNA,按照上述方法对内含子22倒位进行检测。3.3f/2rt-pcr反应取基因组DNA0.5μl(200ng),在25μl反应体系中依次加入10×PCR缓冲液2.5μl、2.5mmol/LdNTP2.5μl、MgCl20.75μl、2F/2R/9F各0.5μl、Taq酶0.25μl、ddH2O15.75μl。反应条件:95℃5min,继之95℃30s、65℃30s、72℃2min,共30个循环。阳性扩增片段为2kb,正常对照为1.5kb,携带者为2、1.5kb两条带。4紫外温升电泳配制1.5%琼脂糖凝胶,PCR产物5μl加入6×上样缓冲液1μl混合,在恒压100V电泳20～30min,EB染色后,经凝胶成像系统于紫外灯下观察电泳结果,见图2。5sry基因rt-pcr反应对其中1例内含子22倒位携带者母亲在孕18周做羊水产前诊断,羊水DNA扩增SRY基因,反应体系同上,反应条件:94℃3min,继之94℃30s、58℃30s、72℃1min,共30个循环,最后72℃10min。电泳后阳性扩增片段为336bp。结果1患者临床诊断结果运用倒位PCR技术对24个家系24个先证者进行内含子22倒位检测,结果发现7例患者为阳性,即电泳结果仅出现559bp条带。进一步核对资料发现,该7例患者经临床诊断,均为重型HA,进一步检测发现7例HA患者母亲中有6例亦为22倒位携带者,提示该6例先证者22内含子倒位系由其母亲传递。本研究内含子22倒位检出率为29.17%,接近临床重型HA内含子倒位25%的发病率。全部24个家系先证者检测未见内含子1倒位情况发生,可能与待检样本例数过少有关。21胎儿染色体核型分析结果上述1例携带者母亲在孕18周要求做羊水产前诊断,经SRY基因性别诊断(图片未提供)及羊水细胞遗传学染色体核型分析,均证实为女性胎儿。同时对羊水细胞DNA进行上述内含子22倒位检测,电泳结果仅出现487bp的条带,说明胎儿不存在内含子22倒位,同时进行内含子1倒位检测,结果阴性。诊断为正常胎儿,产后随访和产前诊断结果一致。haf基因检测血友病A系FⅧ基因缺陷导致的一种遗传性出血性疾病。FⅧ基因全长186kb,定位于Xq28,包括26个外显子和25个内含子,编码长约9kbmRNA。近年来研究表明,约有75%～80%血友病A由基因突变引起,目前已逾900多种突变被报道,表现为点突变、插入、缺失、重排等,大多以点突变为主,且几乎遍布FⅧ基因所有编码区,异常复杂,呈高度异质性。此外,有资料表明,FⅧ基因内含子22倒位约占重型血友病患者的45%,内含子1倒位约占重型血友病患者3%～5%。因此,目前国际上多数学者对血友病患者、携带者进行基因诊断或产前诊断前首先进行内含子22、内含子/倒位检测,若家系成员检测结果阳性即可直接诊断为HA患者或致病基因的携带者。内含子22、1倒位检测属直接基因诊断,对一些HA家系成员不全或由于新生突变致病的患者尤为重要。既往对内含子22倒位检测,国际上多采用Southern印迹法,尽管此法可以鉴别远端及近端倒位,但操作过程复杂、DNA用量大、检测周期长,且需使用放射性同位素标记探针,因此很难用于临床常规检测。随后,国内刘敬忠等报道运用长链PCR(LD-PCR)技术,快速检测FⅧ基因内含子22倒位,并能检出携带者,进行产前诊断。LD-PCR扩增片段长度达12kb,其中包含3.5kbGC岛,对反应体系及酶要求较高,实验操作难度相对较大,对于普通分子实验室推广运用有一定的困难。此外,也有文献报道,LD-PCR对HA患者及携带者检测适用,但对于羊水细胞DNA扩增效果未曾取得满意效果。丁培芳等报道,可通过B超引导下抽取胎儿脐带血进行LD-PCR,但脐血穿刺对胎儿具有一定的创伤性,不易用于常规产前诊断。2005年Rossetti等在国际上首次报道运用I-PCR技术检测HAFⅧ基因内含子22倒位,该方法采用的是普通分子实验室常规技术,简单易行。主要由3步组成,即酶切、T4连接酶连接及PCR扩增。与LD-PCR技术相比,I-PCR扩增产物片段较短,为559bp和487bp,易于实验操作和结果判读,大大降低了LD-PCR的扩增难度,但缺点是实验步骤较LD-PCR略繁琐,检测时间相对延长。我们运用该技术,成功地在24个HA家系中检测出7例患者内含子22倒位,阳性检出率为29.17%,可诊断率为100%,且资料显示该7例患者均来自重型血友病家系,与文献报道基本一致。进一步运用该法对上述内含子22倒位患者的母亲进行携带者检测,结果提示7例患者母亲中有6例系内含子22倒位,直接明确了诊断,同时省却了后续较繁琐的点突变筛查或家系连锁分析。对于其中1例携带者母亲,经患者要求,在其怀孕18周左右抽取羊水,同时行SRY基因性别诊断和内含子22倒位筛查,实验结果与传统羊水细胞遗传染色体核型分析对照,结果显示,待诊断胎儿为女性,内