中国gilmann综合征患者ug1a1基因突变位点的遗传分析

中国gilmann综合征患者ug1a1基因突变位点的遗传分析

吉尔伯特综合征是临床上最常见的遗传胆红素代谢障碍疾病。主要临床表现为非溶血性非结合性高胆红素血症。病变的原因是肝脏微粒体中二磷酸葡萄糖乙酸盐（b-ugt）的代谢。近20余年,分子生物学技术的发展推进了UGT1A1基因结构异常和功能改变的研究。目前已发现不同人群的Gilbert综合征存在遗传背景差异,但这些研究多来自欧美和日本,国内相关报道极少。本研究通过聚合酶链反应(PCR)和直接DNA测序法,对1例中国Gilbert综合征家系作详细的UGT1A1基因突变筛查,确定突变位点,并通过检测血清胆红素水平对基因型与表现型的相关性进行验证,旨在明确其遗传规律。对象和方法一、肝胰腺组织病理学检测结果见表1。在功能先证者男,57岁,已婚,汉族。自幼即有间歇性黄疸,既往多次实验室检查显示除血清非结合性胆红素增高外,其他肝功能指标均正常。甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒标志物均阴性。网织红细胞计数正常,红细胞形态分析未见异常,红细胞脆性试验正常。肝脏B超检查正常。根据肝功能试验和低热量试验结果诊断为Gilbert综合征。同时调查相关家系成员5名,所有受检者均签署知情同意书。采集外周静脉血,行肝功能试验。二、ust1a1基因对寡核苷酸引物的致突变性检测OLYMPUSAU600全自动生化分析仪(日本Olympus公司);基因组DNA提取试剂盒(北京天为时代科技有限公司);UGT1A1基因9对寡核苷酸引物(上海赛百盛基因技术有限公司);EppendorfMastercyclerPCR仪(德国Eppendorf公司);FR-980生物电泳图像分析系统(上海复日科技有限公司);ABI3700型DNA测序仪(美国PE公司);三磷酸脱氧核苷(dNTP)和高保真PCR酶(KOD-Plus-)(日本Toyobo公司)。三、ugt11a基因的遗传分析1.提取的dna参照试剂盒说明,抽取先证者及其5名家系成员的外周静脉血,提取全血白细胞基因组DNA,-20℃保存。2.pcr扩增体系根据人类基因文库数据,采用Primer3.0软件,设计UGT1A1基因上游苯巴比妥反应增强元件(PBREM)、启动子TATA盒和5对外显子(其中1号和5号外显子因片段较长,分别设计了2对引物)共9对引物(见表1)。实验引物浓度均为10μmol/L,以基因组DNA为模板行PCR扩增。反应体系中含50~200ng基因组DNA、上下游引物各10μmol/L、0.2mmol/LdNTP和KOD-Plus-1.0μl,PCR缓冲液补充双蒸水至50μl。反应条件:94℃预变性2min,94℃变性15s,退火30s(退火温度:PBREM、启动子TATA盒、Ex2和Ex4为58℃,Ex1N1和Ex5N1为60℃,Ex1N2为64℃,Ex3为56℃,Ex5N2为62℃),68℃延伸30s,循环30次,68℃终延伸5min。3.琼脂糖凝胶电泳取扩增产物4.0μl行PCR扩增产物分析,1.0μl溴化乙锭染色,1.5%琼脂糖凝胶电泳,生物电泳图像分析系统观察DNA电泳条带并摄影。检测结果采用SmartView软件分析。以pBR322DNA/HaeⅢ作为标准分子质量。4.dna序列分析四、疾病史、良好并发症家系调查问卷内容包括性别、年龄、是否近亲婚配、健康状况、有无慢性肝病、有无遗传疾病史、既往肝功能检查结果、胆红素水平等。获取全部家系成员UGT1A1基因DNA测序分析结果后,根据UGT1A1基因突变并结合胆红素代谢障碍的表现,按遗传作图方法标记出UGT1A1基因突变家系成员的位置,分析突变基因的来源和遗传方式。结果一、正常范围和相对范围先证者及其5名家系成员的血清结合胆红素水平均在正常范围内。先证者(Ⅱ-2)和Ⅱ-3血清非结合胆红素水平显著升高,Ⅱ-4和Ⅲ-1轻度升高,Ⅰ-1和Ⅱ-1正常(见表2)。二、原引物测序以7对引物扩增5对外显子,得到特异性产物后,再以原引物进行测序。将测序结果与基因文库中的序列进行比对分析,排除了该家系UGT1A1基因5对外显子区域的突变。三、t-339g突变对UGT1A1基因上游PBREM的测序结果显示先证者及其4名家系成员存在T-3279G突变,其中Ⅱ-2以及Ⅰ-1、Ⅱ-3和Ⅱ-4为突变纯合子,Ⅲ-1为突变杂合子,Ⅱ-1为正常基因型(野生型)(见图1)。四、ta插入突变对启动子TATA盒序列的扫描结果显示该家系UGT1A1基因启动子存在TA插入突变,即由正常的A(TA)6TAA突变为A(TA)7TAA。其中Ⅱ-2和Ⅱ-3为突变纯合子,Ⅰ-1和Ⅲ-1为突变杂合子,Ⅱ-1和Ⅱ-4为正常基因型(见图2)。五、t1a1基因型根据测序结果,明确了每位家系成员的UGT1A1基因型,以A(TA)7TAA等位基因为基础,结合T-3279G和血清非结合胆红素水平,绘制出家系图谱(见图3)。不同基因型患者的血清激素活性Gilbert综合征的发病原因是位于染色体2q37位点的UGT1A1基因发生缺陷,导致B-UGT表达下降。UGT1A1基因的突变类型较多,且不断有新的突变类型被发现,血清非结合胆红素增高幅度的差异也较大,某些突变纯合子患者甚至可表现为Crigler-Najjar综合征。本研究是国内有关Gilbert综合征UGT1A1基因T-3279G和A(T)7TAA的首例报道。本研究中,UGT1A1基因编码区的5对外显子均无突变,全部内含子/外显子剪接边界位点序列均遵守GT/AG法则,未检测到相关突变。但UGT1A1基因启动子TATA盒发生了TA插入突变,上游PBREM存在T-3279G突变。其中Ⅱ-2和Ⅱ-3为A(TA)7/7TAA纯合子,同时也是T-3279G纯合子,其血清非结合胆红素水平显著高于正常值。Ⅰ-1和Ⅲ-1为A(TA)6/7TAA杂合子,Ⅲ-1的血清非结合胆红素水平略高于正常值,而Ⅰ-1虽处于正常范围内,但该家系成员长期服用苯二氮卓类药物,推测此药物可能对B-UGT的表达有一定影响。Ⅱ-1和Ⅱ-4为正常野生型A(TA)6/6TAA纯合子,Ⅱ-1的血清非结合胆红素水平在正常范围内,而Ⅱ-4略高于正常值,推测后者与T-3279G突变纯合子的作用有关。由此可见,本例Gilbert综合征家系发病是UGT1A1基因启动子TATA盒与PBREM多态性改变共同作用的结果,且UGT1A1基因启动子A(TA)7TAA等位基因对胆红素的影响更为重要。就遗传方式而言,本例Gilbert综合征家系发病符合常染色体隐性遗传。人类不同种属Gilbert综合征的遗传背景存在差异。白种人Gilbert综合征启动子TATA盒TA插入突变的发生率约为30%~40%,几乎均为A(TA)7/7TAA纯合子,不存在编码区突变。日本人群Gilbert综合征TA插入突变的发生率为11%,仅1/3为A(TA)7/7TAA纯合子,没有编码区突变;其余2/3存在编码区突变。研究显示日本Gilbert综合征患者基因突变的类型主要是编码区错义突变,如G71R、P229Q、Y486D等,其中第一外显子的G71R错义突变最为常见。有关中国人群Gilbert综合征遗传背景的研究极少,因此,本研究发现的PBREM和TATA盒突变而无外显子编码区碱基突变的致病特点在中国Gilbert综合征患者中是否具有代表性,尚有待进一步研究。事实上,TATA盒TA插入突变并不是Gilbert综合征发病的唯一原因。Bosma等的体外表达试验发现A(TA)7TAA突变者的B-UGT转录活性为正常者的1/3。Beutler等的研究结果显示A(TA)7TAA突变者的UGT1A1基因转录活性为正常者的60%~80%。研究显示日本Gilbert综合征患者和正常对照者中,基因型为A(TA)7/7TAA突变纯合子者的平均胆红素水平分别为37.7μmol/L和16.2μmol/L,基因型为A(TA)6/7TAA突变杂合子者的平均胆红素水平分别为30.6μmol/L和10.7μmol/L,正常野生型A(TA)6/6TAA纯合子者的平均胆红素水平分别为19.6μmol/L和9.5μmol/L。提示除受TATA盒控制外,UGT1A1基因的表达水平亦受其他调控区域的影响,这解释了相同基因型患者的血清胆红素水平存在显著差异的原因。一般认为,Gilbert综合征患者的UGT1A1基因活性为正常者的30%。最近研究发现UGT1A1基因上游PBREMT-3279G突变也可使转录活性下降60%。由此推测,A(TA)7/7TAA突变合并T-3279G突变可使UGT1A1的转录活性降至30%或更低。PBREM约位于TATA上游3kb区域-3483/-3194,大小为290bp。Maruo等的研究对基因型为A(TA)7/7TAA的11例白种人和12例日本Gilbert综合征患者的研究发现,这些患者均为T-3279G突变纯合子。对日本和韩国人群的研究发现,T-3279G突变与UGT1A1基因转录活性下降和胆红素水平升高显著相关。但白种人T-3279G突变对UGT1A1基因的基础活性和诱导活性均无影响。本研究中,家系成员Ⅱ-4为T-3279G突变纯合子,TATA盒和外显子均无突变,但其血清胆红素水平高于正常范围,符合Gilbert综合征的诊断标准,与Sugatani等的研究中的1例患者完全相同,推测这很有可能是东西方人种Gilbert综合征遗传特征的差异之一。不同人种PBREMT-3279G的TT、TG和GG三种基因型的频率差异非常显著。日本人群中,这三种基因型的频率分别为53%、40%和7%,白种人分别为24%、58%和18%,非洲裔美国人分别为3%、24%和73%。Kitagawa等的研究发现UGT1A1基因-3279位点与TATA盒间存在高度连锁不平衡,TATA盒为A(TA)7TAA时,-3279位点多为G;TATA盒为A(TA)6TAA时,-3279位点可能为G,也可能为T。本研究中,UGT1A1基因-3279位点与TATA盒间也存在类似的连锁不平衡。但这种连锁不平衡在白种人和非洲裔美国人中并不显著,TATA盒为A(TA)7TAA时,-3279位点可能为G或T;而TATA盒为A(TA)6TAA时,-3279位点多为T。提示这一特征很可能是东西方人种Gilbert综合征遗传特征的又一差异。值得注意的是,UGT1A1基因有许多外源性底物。这些底物可通过竞争UGT1A1基因而导致黄疸,影响某些物质的代谢。这对UGT1A1基因活性仅为正常人30%的Gilbert综合征患者显得尤其重要。据报道,单一T-3279G突变杂合子患者出现伊立替康严重毒性反应的危险性较正常基因型者高1.24倍,如T-3279G突变杂合子合并A(TA)6/7TAA,则危险性高达6.2倍。因此,检测肿瘤患者是否携带T-3279G突变和(或)A(TA)7TAA突变,可很好地预测抗癌药物伊立替康可能发生的严重不良反应。Adegoke等的研究认为,A(TA)7TAA等位基因增加了中国汉族40岁以下女性患乳腺癌的危险性。由此可见,Gilbert综合征并不是传统概念上完全良性的疾病,研究UGT1A1基因多态性对其活性的影响至少具有遗传药理学和肿瘤遗传学意义。有关UGT1A1基因的研究表明Gilbert综合征与Crigler-Najjar综合征Ⅱ型之间在胆红素水平和基因突变位点均存在交叉,这对两者的传统诊断标准提出了挑战。既往确诊Gilbe