dna纳米自组装技术研究进展

dna纳米自组装技术研究进展

dna是脱氧核糖（abu）的简称，是一种重要的脱氧核糖聚合物。每个准分酸由三种成分组成：脱氧核糖（戊糖）、磷酸和氮碱基。不同的氨基酸碱基是碱基。有两种碱基酪氨酸，包括5-磷酸和牛仔布（g），吡啶类包括硝基吡啶（g）和胸腺吡啶（t）。磷酸之间通过磷酸二甲酯键连接，即5-磷酸羟基和其他羟基羟基形成共价键。这两个亚链可以通过碱性基对之间的氢键进行反向组合，形成两个链对的原则。a（或t）和其他链（或a）的反应是两个氢键。一个链的c（或g）和另一个链（或c）的反应是三个氢键。在大多数情况下，两个互补的d-单链是右手螺旋结构中亲水磷酸和糖基的骨架，以及稀疏水中的氮和碱基的两个部分。碱基的平面与螺旋的螺旋轴垂直，螺旋旋结构宽2nm，螺距3.5m。这些性质决定了设计中最低磷酸分子的适应性，因为磷酸分子链之间有严格的碱性配合原则。在dna结构中，碱基之间的氢键固定在一起，并且钠链之间的距离保持不变。因此，碱性组合应遵循碱性组合的原则，这意味着以碱性分子为基础的自组装必须严格可靠、易于重复。DNA纳米技术最大的优势之一就是我们可以随心所欲地设计结构,使得单独的DNA序列能够按照设计组装形成我们想要的结构.在整体大结构设计方面,目前有3个比较常用的方法:(1)模块结构组装(tile).此方法的设计理念在于,将目标结构分解成更小的结构单元,利用每个结构单元里核酸链直接的强作用力以及结构单元之间略弱的作用力,使得整个结构得以形成.一般可以用来组装周期性重复的结构,而且这种策略给DNA计算提供了一个非常好的平台.在DNA折纸术出现之前这个方法一直是主流的自组装方法.(2)折叠结构组装.不同于模块结构组装,DNA折纸术(DNAorigami)的方法利用一条足够长的DNA单链为模板,来回折叠形成一个大的模型,同时利用互补的短链来固定并形成特有的机构.(3)动态组装.这个方法意在直接控制DNA自组装的动力学,通常利用发卡结构(haripin)作为反应的出发点,不断利用单链区(toehold)的链取代进行串联反应并最终得到反应产物.这个方法的优势在于对纳米结构的动态控制上,这也是不同于上面两种组装方式的一点.下面我们就这3种方法对DNA纳米技术的发展和现状做简单介绍.1模块组合的纳米纳米结构1.1holida交叉结DNA碱基序列的多样性以及互补DNA序列之间的特异性结合赋予了其在生物学上的许多已知或未知的重要功能.通常情况下,DNA以线性双螺旋结构存在,从拓扑结构看,其中心轴不存在分支.1964年,美国科学家RobinHolliday为解释同源重组提出了著名的Holliday模型.同源重组时,两个DNA双螺旋同源链的相应位点产生单链断裂,切口产生的游离末端可以移动,每条链都脱离其配对链并与另一双螺旋中的互补链配对,形成一种特殊的双螺旋交叉结构,即Holliday交叉结.Holliday模型的提出不仅推动了分子生物学的发展,同时也触发了DNA纳米技术领域的研究灵感.1983年,Seeman研究小组首次在溶液中组装出稳定的(不会发生与基因重组过程中类似的分支迁移现象)Holliday分支结构.该结构由4条短链DNA相互杂交形成四臂结构,每条臂上包含8个碱基对,如图1(a)所示.他们依据DNA结构在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳淌度以及DNA热变性所引起的紫外增色效应等,验证了所形成的分支DNA结构.Holliday交叉结的成功设计,为组装具有空间复杂性的DNA纳米结构奠定了基础.1.2存在于dae和dapon的双交叉结结构DX模块是指两条并置的双螺旋DNA通过两个Holliday交叉结连接成一体的特殊DNA结构.较之普通的DNA双螺旋,DX模块的结构刚性大大增加,因此适合于构造具有空间复杂性的DNA纳米结构.1993年,Fu和Seeman报道了关于DX模块的设计和组装方面的工作.他们一共设计了5种不同结构的DX模块:DAE(反平行,结间距离为偶数个half-turn),DAO(反平行,奇数个half-turn),以及3种平行取向的DX结构DPE、DPOW和DPON.聚丙烯酰胺凝胶电泳显示:3种平行取向(DNA链经过交叉结进入另一条双螺旋后不改变其走向)的DX分子不太稳定容易解链或者形成多聚体,而两种反平行DX模块(即DAE和DAO)则能以稳定的双交叉结形式存在(图1(b)).DX模块由两个4臂交叉结(Holliday交叉结)构成,可以设计黏性末端实现不同DX模块之间的特异性结合,进而组装得到周期性的一维或二维DNA晶格结构.在DX模块的基础上,研究人员进一步设计了含有不同DNA双螺旋数目的组装模块,以满足构建更为复杂多变的DNA纳米组装结构的需要.2000年Labean等人报道了含有3个DNA双螺旋区域的交叉结组装模块(图1(c)),以该模块作为基本单元,组装得到周期性、结构可控的DNA二维晶体.2005年Adleman研究组设计了含有4个双螺旋区域的组装模块(图1(d)),模块之间可通过黏性末端相互连接得到了具有较小孔洞面积和较高DNA面密度的二维平面结构.同年,Seeman研究组报道了一种含有6个DNA双螺旋的交叉结组装模块,并基于合理的结构设计得到DNA纳米管和二维阵列结构.1.3角形模块对于简单的四臂Holliday交叉结,由于每条臂均为DNA双螺旋结构,结构刚性较弱,通常情况下并不适合用作纳米结构的组装模块.在此基础上,Yan等人于2003年设计了含有4个四臂交叉结的十字形组装模块,如图1(e)所示.十字模块的每条臂均由两个DNA双螺旋通过一个交叉结连接组成,其增强的结构刚性有利于复杂结构的设计和组装.随后Mao研究组对十字模块进行了延伸,设计了刚性的三角形模块,由3个等同的Holliday交叉结两两融合而成(图1(f)).三角形的每个顶点均为四臂交叉结每个Holliday交叉结的两条臂对应三角形的两条边另外两条臂可以用来设计黏性末端.三角形的三条边长度相等且具有较强的刚性,在此限定下,其3个内角都为60°,具有特殊的结构稳定性.2005年,Mao研究组设计了三点星状模块.该模块由3条DNA相互缠绕而成,可看作十字模块的一个变体(图1(g)).其中心处延伸出3个分支,每个分支由两条DNA双螺旋通过Holliday交叉结连接而成.通过控制3个分支在中心连接处的柔性,该模块可被组装成DNA平面阵列或多面体结构.该模块的设计很好地体现了序列对称性的设计思想,能够一步、高效地形成所期望的平面或三维多面体结构.除三点星和四点星(即十字模块)之外,五点星和六点星结构模块也被成功用于DNA纳米结构的组装.除了在复杂性方面的尝试以外,Mao研究组利用回文结构对DX模块进行了对称化的简单处理,只利用两条链就能形成二维结构,在去掉曲终的一条侧链以后,剩下的结构依然可以自组装,只是由于缺乏更多刚性束缚,结构变成了管状.1.4大尺寸组合结构的生成值得一提的是,Yin等人在2008年利用两对互补序列构成一条四区域长链(图2(a)),然后把这条链作为一个单链模块(他们称之为single-strandedtileSST)进行自组装,如图2(b)示,结果显示即使是这么简单的单链模块也能很好地形成大的结构,组装的图形包括了纳米带和纳米管两种,同时可以通过控制参与组装的tile种类来控制他们的宽度,如图2(c所示.2012年,Yin研究组发展了以SST为基础的大平面组装,和DNA折纸术一样,这个方法也不需要反应物严格控制计量比和纯度,但是作为以短链结构SST作为组装基元的方法,没有中心长链的支撑,也可以得到纯度和效率都很高的产物,让大家开始重新考虑tile组装的原理(图3(a)).2013年Ke等人就在这个概念的基础上更进一步得到三维的组装结构,如图3(b).2基于成核链的非对称结构的我国dna纸媒在tile自组装中,多数都是通过DNA先形成一个稳定的可编码tile模块,然后再进一步组装出高级结构的,这一过程又称为层次自组装(hierarchicalassembly),与之相对的就是成核自组装(nucleationassembly),即整个组装过程中围绕某些成核点一次进行.这一组装其实也是tile组装的延伸,主要是利用tile进行的算法自组装,这部分工作的主要初衷是打算通过控制DNA分子间的生化反应来完成数学运算,它起源于1994年Adleman成功地用DNA一维自组装解决了7顶点的汉密尔顿路径问题.随后LaBean的异或运算,Yan等人用拷贝运算得到的一维条形码等,都是这些工作的延续.2004年,Shih等人首次把成核链用于构造图形,他们用一条DNA单链配合另外5条较短的互补链,形成了一个八面体的结构.2006年,Rothemund基于这个思想,使用一条长达7249个碱基的单链DNA作为骨架链,加上用来绑定的辅助链,构建了一个完整充实的二维结构.然后通过设计不同的辅助链,Rothemund成功地用DNA折纸术得到了方形、矩形、五角星、笑脸以及两种不同的三角形(图4).最初Rothemund设计的这些结构都是平面实心的对称的图形,后来上海交通大学和上海应用物理研究所合作用DNA折纸术做出了一个中国地图的形状(图5),这是第一个非对称性的图形.而后沿着这个方向,三维DNA折纸术开始被研究人员所重视,2009年Andersen等人利用DNA折纸术折出了一个六面体的空心盒子;Ke等人也用类似的方法得到了一个空心四面体.两者不同在于,前者是把六面体的每个面都单独折叠,而后者是采用的整体化设计.同时,William小组[23~27]构造了更多的三维实心图形,包括多面体和有孔三维结构等很多精确控制的结构,与最初的Rothemund的二维设计不同的地方在于,辅助链被从32个碱基降到了21个碱基,这样就避免了每3个turn就多余0.5碱基的扭力积累,同时褶皱状的排布还可以有效地降低核酸链之间的静电斥力.2011年,Yan研究组跳开刚性点阵模型,只通过支架结构来定义目标物体的特征,通过调节DNA结构,构建连接构架非常完美地在3D表面上达到了修改细微曲率的任务.这一方法指出单纯通过改变交叉连接点之间核苷酸的数目和交叉位置就能设计出不同的二维结构,同样这样改变也适用于平面内外曲率的结构构造中.最终他们以构建同心环结构的方式,与非B型构型DNA结合,得到了很多精巧的结构(图6),比如球体、半球体、椭圆壳形以及纳米花瓶,这次突破给DNA折纸术三维自组装掀开了新的篇章.3动态dna纳米技术动态DNA纳米组装主要是指建立具有动态功能的核苷酸体系,比如DNA计算和DNA机械运动DNA组建的纳米机械装置是指通过改变条件从而使DNA复合物的构型发生变化,是一种特殊形态的纳米机器人.1999年Mao等人利用改变溶液buffe促使B-DNA和Z-DNA构型的相互改变.随后Bernard研究组设计了一种以DNA为能量来源的分子镊子.2002年Yan等人设计了另外一种DNA机器来界定PX构型与JX2构型之间的转换.同时这些DNA组装的纳米器件还被赋予了运输的功能通过结构的动态开关来实现功能性货物的运输[32~34]除了构型转换和模拟开关这两类纳米器械以外,还有一种很新颖的纳米装置就是DNAwalker,这类装置是指DNA纳米机器沿着特定的方向有序行走,其中包括很多策略.最初的设计者通过手动加入指示链达到使DNAwalker行走的目的,而后,Tian等人和Bath等人分别设计了通过脱氧核酶或限制性内切酶来消除walker通行的障碍,这样DNA就可以顺着预定的方向自发地移动.随后DNAwalker的行走方向从线性方向被拓展到二维平面.需要指出的是,DNAwalker这样的纳米机械被有机合成方面的学者敏锐地利用起来作为多步化学合成的指示器,这类反应也就被称为DNA指导的化学合成.正因为动态DNA纳米技术在机械装置方面的独特性质,使得越来越多的研究人员开始从DNA静态结构的自组装方向向DNA机械组装方向拓展,这些装置包括电路、催化放大器、自动分子马达和可重构纳米结构.而在这些装置里,最常用的反应模式就是链取代反应,图7可以简单说明此反应的原理和应用.链取代反应是指与目标序列完全或者部分互补匹配的DNA链,取代其中一条预杂交好的DNA链的过程,反应是一个竞争过程.此反应过程起始于目标结构的单链区(toehold),目标DNA通过分支迁移可以取代掉预杂交的一条DNA链.而被取代下来的DNA链同样可以作为下一个链取代反应的启动链,这样的串联控制就形成了一个以链取代反应为基础的网络结构,从而使得复杂的计算机计算和信息处理成为可能.同时,链取代反应可以在恒温条件下发生.链取代可以用来设计能实现负责逻辑运算的分子逻辑门,不同于传统的电子器件计算机,分子计算机使用特定的化合物的浓度作为信号的输入输出,在核酸的链取代通路里,信号可以被视作某一条参与了链取代反应的DNA单链的浓度,通过取代和被取代,这条链会被消耗或者释放,从而达成输出信号的控制.这个方法所设计的逻辑门包括与门(AND)或门(OR)和非门(NOT).在这些研究的基础上Winfree研究组提出了以DNA构建的可以对0到15实现开方运算的四比特分子通路,在他们的体系里核心的序列是一条130个碱基的DNA单链,如图8所示.除此之外,链取代也可以被用来组装动态的纳米结构.首先使用DNA分子发卡作为反应物,这样和取代链反应后即使被结构打开,依然没有从反应物中分离,DNA分子发卡中被打开的一部链可以作为启动链继续打开新的反应物.这个反应也可以用来构建简单的三臂、四臂交叉结和树枝状大分子.DNA组装的纳米器件除了被发展成具有运输和计算作用的机器以外,还具有智能控制纳米装置的能力,并且可以使更多的装置表现出强大的功能性[45~47].例如,可以在DNAorigami模板上通过控制DNA机器的起始状态从而完成对其运行过程的精确控制,这种可以通过设计来调控的自动移动可视为DNA纳米级别的“生产线”;为了实现更多的功能化纳米机器,有研究组利用设计的分子机器人(类似于DNAwalker的原理)在DNAorigami模板上实现“起、承、转、停”等功能,这种被称为分子蜘蛛的机器极大地丰富了DNA纳米器件的应用性,同时也向大家展示了人为设计的可控性所能实现的功能化作用.4纳米dns技术的应用4.1动态dna纳米技术以DNA自组装图形为模板或衬底,通过各种修饰或反应,构成小分子或颗粒的特异或非特异的纳米级别精确排布有诸多优点:能排布的对象多,包括各种生物分子与纳米颗粒,原则上只要能与DNA链发生反应即可;DNA自组装图形都是纳米级别分辨率,与宏观的排布形成鲜明对比;能够精确定位,参与自组装的往往有多条链,在哪条链上做修饰,最终就在哪里排布;操作相对简单,因为DNA模板是自底向上自组装的,唯一要解决的就是排布对象与DNA的连接问题.(1)核酸.首先就是利用DNA的自组装模板对核酸进行功能化排布.2005年Lund等人在4×4til形成的田字形网格上面伸出寡核苷酸链,采用链霉亲和素标记的方法在AFM下观察,平均效率达64%2008年Ke等人开发了DNA折纸芯片,通过V字形探针的设计方式,能够在AFM下直接检测到杂交结果,从而实现无标记的检测.之后他们还专门讨论了探针的位置效应.除了排布简单的DNA探针实现检测,另一个有趣而实用的方向是把DNA自组装图形和DNA纳米器件结合起来,构造可寻址的功能性核酸链阵列,这部分的应用我们在对动态DNA纳米技术一节里已有较为详细的介绍.(2)蛋白质.2003年,Yan等人在发明4×4til的文章中首次报道在DNA自组装图形上排布了链霉亲和素蛋白.两年后,Park等人使用两种tile构图简单地控制了链霉亲和素的位置和距离.此后不久他又进一步做出4×4的有限网格,并在上面特异的地方修饰链霉亲和素,显示出“DNA”的字样,充分体现了对蛋白位置的可控性.由于核酸适配体本身也是核酸构成的,所以连接在DNA自组装结构中非常方便,目前一般是用它来结合蛋白.2005年,Liu等人通过在TX的茎环上连TBA,实现了凝血酶的一维排布.2007年,Chhabra等人把多种蛋白在同一个DNA模板上(包括DX-array和折纸术矩形)进行特异性可编码排布.一年后,Rinker等人用同样的方法,通过控制核酸适配体间的距离,使两个核酸适配体结合一个蛋白(称为多价结合,multivalentbinding),并进一步把它与单价结合的亲和力进行比较.还有一种方法就是利用共价连接DNA和蛋白,并且利用DNA的杂交达到将蛋白固定在组织模板上的目的.这样做可以有助于我们对蛋白质相互作用的认识以及酶反应动力学和机理的研究.4.2金纳米颗粒的修饰修饰最常用的纳米金颗粒(Aunanoparticle,AuNPornanogold)在水中形成的分散系俗称胶体金,金颗粒可与氨基发生非共价的静电吸附而牢固结合,与巯基之间形成很强的Au2S共价键,后者也是最常用的纳米金与DNA的结合方式.金纳米颗粒的组装最初是利用寡核苷酸杂交法.2004年,Seeman研究组率先用杂交法实现了AuNP的条纹排列.次年,他们又完成了两种大小AuNP的有序交叉排列.这两次都是在DX-array中排布的.Yan研究组把基底改为4×4tile的网格,这种图形的好处是tile间距大且位阻效应小,实现了纳米金的等间距排列(保证每个金球只连在一个位点上).当然,也有在金纳米颗粒上直接组装DNA的例子.2008年,Sharma等人所利用的高效组装方法能得到90%以上的产率,他们把巯基修饰的DNA改为用酯化的硫辛酸修饰,从而与金的结合由一个巯基(monothiol)变为了两个硫键(dithiol).Kelley研究组通过对DNA碱基骨架的巯基修饰来代替通常的末端修饰,从而使得DNA和无机纳米材料的作用力更加牢固,他们使用量子点作为载体,可以形成非常规则的各种形式的复合物,而修饰组装了DNA的量子点的光电性质可以给光学性质的检测、太阳光储能以及生物学性质的研究带来更多的选择(图9).4.3dna八面体的组装DNA纳米技术也可以被扩展到做检测.早在1991年,Seeman等人就利用10条DNA链在溶液里组装成了一个DNA立方体;随后还有不同策略下利用DNA组装而成的DNA八面体.这些组装的策略复杂,组装的效率比较低且结构比较松软.真正能够用在生物传感检测是在2005年Go