超高效液相色谱串联质谱联用技术检测蜂蜜中12种大环内酯和林可酰胺类抗生素残留

超高效液相色谱串联质谱联用技术检测蜂蜜中12种大环内酯和林可酰胺类抗生素残留

大环内酯类抗生素是放线菌或小单胞菌产生的一种合成药物。它对革兰氏阳性和具体生物的细菌感染有很强的抑制作用。广泛用于医学和现代医学对细菌感染的治疗和预防。然而，大环内酯类抗生素的残留会引起过敏反应，并会导致药物不利的扩散。林可酰胺类抗生素(lincosamides)是具有抗革兰阳性需氧菌和革兰阳性或阴性厌氧菌活性的抗生素,通常用于需氧及厌氧混合感染的治疗,林可酰胺类抗生素残留可引起肾功能障碍和革兰阳性菌的耐药性增加。大环内酯和林可酰胺类抗生素可用于防治蜜蜂的美洲幼腐病,林可酰胺类和大环内酯类兽药由于药效好,广泛用于蜜蜂疾病的预防和治疗,其在蜂蜜中残留问题不容忽视。目前各国尚未设定蜂产品中大环内酯和林可酰胺类抗生素残留的最大限量要求(MRL),但按日本肯定列表要求每种药物的残留限量不得超过10μg/kg,因此建立快速测定蜂蜜中低含量大环内酯和林可酰胺类抗生素残留的检测方法非常必要。大环内酯和林可酰胺类抗生素残留检测方法主要有高效液相色谱法、液/质联用法(LC-MS/MS)。高效液相色谱法测定时通常使用紫外检测器,灵敏度较低,阳性样品还需进一步确证;LC-MS/MS作为确证检测兽药残留的理想方法,目前已应用于蜂蜜中多种大环内酯和林可酰胺类抗生素残留的测定,但样品前处理比较复杂,一般都采用固相萃取方法,成本高,操作烦琐。本研究建立的UPLC-MS-MS方法,无需固相萃取等复杂样品前处理技术,样品经溶剂溶解后直接进样分析,可以快速检测蜂蜜中12种大环内酯和林可酰胺类抗生素残留,方法简便、准确,可以满足大批量样品高灵敏的测定,为食品安全提供可靠的确证检测方法。1材料和方法1.1标准使用液的配制AquityUPLC-QuattroPremierXE超高效液相色谱-串联质谱仪,配有电喷雾离子源,Masslynx4.1工作站(美国Waters公司);MS2旋涡混旋器(德国IKA公司);TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);2510超声波清洗机(美国Branson公司);GradientA10Mill-Q超纯水器(法国Millipore公司);20μl~300μl电子移液枪(法国Gilson公司);针头过滤器(13mmGHP0.2μm,美国Pall公司)。甲醇和乙腈为HPLC级(德国Merck公司);乙酸铵为HPLC级(美国Tedia公司);泰乐菌素(98.0%)、螺旋霉素(96.0%)、替米考星(98.5%)、竹桃霉素(96.5%)等标准物质购自德国Dr.Ehrenstorfer公司;红霉素(92.3%)、克拉霉素(97.5%)、林可霉素(86.2%)、克林霉素(86.5%)、吉他霉素、交沙霉素、阿奇霉素、麦迪霉素和罗红霉素等化学对照品购自中国药品生物制品检定所;分别用甲醇配制成1.0mg/ml标准贮备溶液,再混合稀释成10μg/ml混合标准使用液,保存于-35℃冰箱中。临用时用甲醇稀释至所需浓度。1.2罗红霉素-罗红霉素的制备对无结晶的蜂蜜样品,将其搅拌均匀。对有结晶的样品,在密闭情况下,置于不超过60℃的水浴中温热,振荡,待样品全部融化后搅匀,冷却至室温。称取混合均匀的试样1.00g,置于10ml具塞离心管中,加入500μl2mol/L乙酸铵水溶液、20μl内标物罗红霉素(1.0mg/L),加20%甲醇水溶液至5.0ml,旋涡混匀,超声5min,取上清液1.0ml于safe-lock尖底离心管中,12000rpm离心5min,取中层清液待测。在7支具塞离心管中各称取1.00g空白样品,加入500μl2mol/L乙酸铵水溶液、20μl内标物罗红霉素(1.0mg/L),分别按加入适量的混合标准液,使12种待测物的浓度分别为:0μg/kg、0.50μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg、50.0μg/kg、100μg/kg、200μg/kg,余下操作同样品的处理方法,供制作基质工作曲线用。1.3测量条件1.3.1柱温mm色谱柱:ACQUITYUPLCHSST3柱(100mm×2.1mm,1.8μm),VanGuardBEHC18保护柱(5mm×2.1mm,1.7μm)(美国Waters公司);柱温:45℃;样品室温度:5℃;进样体积10μl。流动相A为含0.5%甲酸的5mmol/L乙酸铵水溶液,流动相B为甲醇液,流速为0.200ml/min,采用梯度洗脱,在1.5min内流动相B从40%线性梯度至60%,再在2.5min内线性梯度至80%并保持2min,在0.1min内增加至95%再保持2min,然后流动相B的比例下降至40%,平衡色谱柱2min。1.3.2质谱参数采用电喷雾离子源,通过正离子多反应监控扫描(MRM)模式,毛细管电压:3.2kV;离子源温度:130℃;锥孔反吹气流量:50L/hr,脱溶剂温度:380℃,脱溶剂气流量:600L/hr,碰撞室氩气压力:0.346Pa(3.46×10-3mbar)。其它质谱参数详见表1。运行开始时,色谱柱流出液经六通切换阀切换至废液中直到1.6min,质谱从1.6min开始采集数据直到5.5min结束,同时六通切换阀又将柱流出液切换至废液中。2结果与讨论2.1质谱条件优化分子离子检测利用注射泵以20μl/min流速将每种2.0μg/ml的待测组分标准溶液通过三通管汇合一定比例的流动相注入到离子源中,在正离子模式下,得到每种组分的准分子离子峰。然后对每种准分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描),得到碎片离子信息,然后再对锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化,使每种组分的准分子离子与产生的特征碎片离子对强度达到最大;然后将UPLC和串联四极杆质谱仪联机,选择每种化合物的监测离子对,再对离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量等进行优化,使样液中每种待测物的离子化效率达到最佳。遵循国际惯例,确证分析需要4个识别点,选择两对分子离子对,再选择干扰小、信噪比大的离子对作为定量离子对。设定合适的峰驻留时间(dwelltime)确保色谱峰的采样点数在15~20点,从而得到较好的定量重复性。优化后的测定条件见表1。2.2流动相的优化ACQUITYUPLCHSST32.1×100mm,1.8μm柱作为分析柱,分别采用不同浓度的乙酸铵水溶液和乙酸铵甲醇液系统作为流动相进行优化,试验发现在流动相A中加入甲酸时灵敏度和分离效果都更好,流动相B中加入不同浓度乙酸铵溶液,影响不明显,故最终选用流动相A为含0.5%甲酸的5mmol/L乙酸铵水溶液,流动相B为甲醇液,选择适当的梯度洗脱程序使13种待测组分得到较好地分离,一次分析仅需10min。2.3蜂蜜提取的回收率测量大环内酯类和林可酰胺类抗生素均为弱碱性化合物,易溶于酸性水溶液和极性溶剂,在pH6-8的中性溶液中较稳定,在酸性(pH<4)和碱性(pH>9)条件下均不稳定,特别是红霉素、替米考星、阿奇霉素和螺旋霉素对酸非常敏感。文献报道的样品净化方法主要有正己烷液液萃取脱脂和固相萃取法,试验发现罗红霉素、替米考星、阿奇霉素和螺旋霉素脂溶性较大,在近中性条件下用正己烷脱脂,损失较大,回收率仅有38%~51%;固相萃取法的柱类型主要有反相的C18和HLB、阳离子交换的MCX和SCX。采用阳离子交换固相萃取法时,样品的上样溶液要调至酸性,洗脱液也为酸性,通常含有5%甲酸,而这些酸性条件都会使某些酸敏感的大环内酯类成分分解;而基于反相机理的固相萃取法与反相液相色谱柱分离的机理相同,反相固相萃取去杂质的效果采用反相液相色谱分离结合在线切换阀流路切换技术也能达到,增加固相萃取净化,洗脱液还需氮吹浓缩,反而增加了样品前处理的步骤,使之冗长、耗时。综合上述原因,本法不经净化,将蜂蜜样品用20%甲醇水液溶解稀释5倍后直接进样分析,采用在线切换阀切换技术将色谱柱最初流出的含有糖类、有机酸等强极性成分的组分切换至废液中,质谱只对待测成分流出部分进行检测,最后又将甲醇强洗脱的弱极性组分切换到废液中,避免质谱仪受到污染。为了尽可能地减少基质效应的影响,采用以罗红霉素作为内标物的基质工作曲线内标法定量。蜂蜜富含有有机酸,pH值多呈酸性,试验发现蜂蜜直接用20%甲醇水液溶解后进样分析,红霉素、替米考星、阿奇霉素和螺旋霉素的回收率仅有54%~72%,故在溶剂提取之前先加入500μl2mol/L乙酸铵使得蜂蜜的pH值调节至近中性,可有效地避免待测物在提取过程中分解,显著增加红霉素、替米考星、阿奇霉素和螺旋霉素的回收率,采用20%甲醇水液可较好地溶解蜂蜜样品,再加以超声提取能提高待测物的提取率。实验发现阿奇霉素、螺旋霉素和替米考星会被0.22μm的滤膜吸附,标准的0.1%乙酸乙腈液通过滤膜后的回收率仅有63%~71%,故提取液经高速离心后直接进样。为了进一步确保待测物的稳定,防止其在液相进样前分解,将样品室的温度设为5℃。2.4定量离子对检测的影响用阴性样品加入标准溶液制作6点系列基质标准工作溶液,以罗红霉素作为内标,在选定的色谱和质谱条件下进行测定,进样量10μl,基质标准色谱图见图1。采用Masslynx4.1中Targetlynx组件以定量离子对的峰面积与内标物的比值对基质标准工作溶液中被测组分的浓度作图,12种待测物在0.50μg/L~200μg/L呈线性关系,相关系数均大于0.999,以定性离子对与定量离子对的峰面积比值作为确证依据。在本法操作条件下,信噪比为3时,定量离子对信号对应的样品浓度为检出限(LOD);信噪比为10时,定量离子对信号对应的样品浓度为定量限(LOQ),具体结果见表2。12种待测成分的检出限均在0.1μg/kg~1.0μg/kg之间,能够满足蜂蜜中药物残留检测的要求。2.5反应物回收率和精密度试验用阴性蜂蜜样品进行加标回收率和精密度实验,样品先加入500μl2