替米考星体外诱导病原菌对3种替米考星的耐药性

替米考星体外诱导病原菌对3种替米考星的耐药性

替米沙恩是一种半合成药物类，具有牛皮屑、巴氏杆菌和猪胸膜肺炎的强烈抗菌活性和抗菌后效应。此外，它还具有快速吸收、药物半衰期长、大循环体积、组织（尤其是肺组织）药物浓度高等药物动态功能。因此国内外已批准替米考星用于畜禽感染性疾病治疗,特别是用于防治呼吸道疾病如牛羊巴氏杆菌病、猪放线杆菌胸膜肺炎和鸡慢性呼吸道病等。目前已有不少替米考星药效学、药动学及残留检测的研究报道,但缺乏相关病原菌的耐药性研究。本文报道了替米考星体外诱导鸡毒支原体、多杀巴氏杆菌及猪胸膜肺炎放线杆菌耐药性的试验结果,以便为兽医临床合理应用替米考星提供参考。1药物的诱导表达试验用3株鸡毒支原体、4株多杀巴氏杆菌和5株猪胸膜肺炎放线杆菌。3株鸡毒支原体中PG31为模式株,S6为强毒抗原株,BG44T为北京地方株;4株多杀巴氏杆菌,分别来源于猪(C44-40)、牛(C45-5、C46-15)和兔(C51-3),分属不同血清型;5株猪胸膜肺炎放线杆菌(App259～App262,App268)均为临床分离株,分属不同血清型。以上菌株均由中国兽医药品监察所提供。替米考星:批号02042001,含量90.2%,购自山东济兴医化(集团)有限公司。红霉素:批号KH10596,效价897U/mg;泰乐菌素:批号K6052000,效价1006U/mg;吉他霉素:批号K0150201,效价1677U/mg;林可霉素:批号K0100402,效价863U/mg,均购自中国兽医药品监察所。阿奇霉素:批号041202,效价751U/mg,购自浙江新昌国邦兽药厂。鸡毒支原体培养采用FM-4培养基,按段晓东介绍的方法配制;多杀巴氏杆菌培养采用添加了5%猪血清的MH肉汤和MH琼脂;猪胸膜肺炎放线杆菌培养采用添加了1%NAD和5%猪血清的PPLO肉汤和PPLO琼脂。替米考星、阿奇霉素和吉他霉素先用少量无水乙醇溶解,再以5%乙醇溶液定容,分别配制成1280μg/mL和5120μg/mL两种浓度;红霉素溶液、泰乐菌素和林可霉素先用少量无水乙醇溶解,再以pH7.8的磷酸缓冲液定容,分别配制成1280μg/mL和5120μg/mL两种浓度。采用微量稀释法进行。用液体培养基将测试菌株原培养液稀释成105CFU/mL(鸡毒支原体为105CCU/mL),在96孔细胞培养板每排的第1孔加入稀释菌液180μL,第2～10孔分别加入100μL。于每排的第1孔加入测试药物溶液20μL,混匀后吸取100μL加入第2孔,按此方法顺次稀释至第10孔后弃去多余的100μL,第11孔不加测试药物作阳性培养对照,第12孔加100μL液体培养基作空白对照。加盖密封后37℃培养24h(鸡毒支原体培养7～14d),在衬有黑色底板的光线下观察,细菌生长孔培养液呈弥散状浑浊或底部有圆形或丝网状沉淀(鸡毒支原体生长孔培养液颜色由粉红色变为橙黄色)。以抑制菌株生长的最高稀释度作为测试药物的MIC。每种药物的MIC重复测定3次。用液体培养基将敏感菌株培养液稀释成105CFU/mL(鸡毒支原体为105CCU/mL)后加入到24孔细胞培养板每排的第1孔至第6孔,第1孔加入1.8mL,第2至第6孔分别加入1mL。然后在第1孔中加入0.2mL替米考星药液,使药物浓度达到拟诱导菌株的8MIC,混匀后取1mL加入第2孔,按此方法顺次稀释至第6孔后弃去多余的菌药液混合物1mL,使每排6个孔的药物浓度顺次为诱导菌株的8、4、2、1、0.5和0.25MIC。加盖密封后37℃培养24h(鸡毒支原体培养7～14d),观察各孔内菌株生长情况。将有菌株生长的最高药物浓度孔培养液保留并制备菌液,以该孔药物浓度为中间值,按2倍梯度设6个药物浓度,如上所述进行下一代耐药性诱导。耐药性诱导试验结束将最后一代诱导试验中有菌株生长的最高药物浓度孔培养液取出0.1mL涂布于固体培养上,37℃培养24h(鸡毒支原体培养7～14d),随机挑取3个单菌落,无药培养3代后按1.5项所述方法测定替米考星、红霉素、泰乐菌素、吉他霉素、阿奇霉素、林可霉素这6种抗菌药物对诱导株的MIC。2替米考星的耐药性2.1替米考星对鸡毒支原体、多杀巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度替米考星对鸡毒支原体的MIC为0.004～0.008μg/mL,对多杀巴氏杆菌的MIC为1μg/mL,对猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC为0.5～1μg/mL。结果显示,同种菌不同菌株之间的MIC较为一致,鸡毒支原体对替米考星十分敏感。2.2替米考星体外诱导鸡毒支原体、多杀巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的耐药性鸡毒支原体、多杀巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌对替米考星耐药性的体外诱导结果分别见图1、图2和图3。图中曲线上的点代表各代菌株能耐受的最高药物浓度。在替米考星作用下继代培养,鸡毒支原体可快速产生耐药性。1～5代间鸡毒支原体对替米考星的耐药性发展平缓,耐药水平也较低(耐受药物浓度不足0.1μg/mL),但随后耐药水平快速提高,到第9代可耐受256μg/mL的药物浓度,3株鸡毒支原体耐药性的诱导速率较一致;替米考星在体外也较易诱导多杀巴氏杆菌的耐药性。在递增浓度药物作用下,4株多杀巴氏杆菌的耐药性发展虽稍有差异,一些代次的菌株可耐受的药物浓度甚至有回落现象,但经7～9代诱导所有菌株均可耐受256μg/mL的药物浓度;体外较难诱导猪胸膜肺炎放线杆菌的替米考星耐药性,在含药培养基中14次继代培养,猪胸膜肺炎放线杆菌可耐受的替米考星浓度虽然在某些代次有所上升,但5株菌在第14代后可耐受的药物浓度仍与敏感株相同。2.3鸡毒支原体、多杀巴氏杆菌替米考星诱导株对大环内酯类药物及林可霉素的敏感性鸡毒支原体和多杀巴氏杆菌的耐药性诱导试验结束后,分别从各菌株的最后一代诱导试验培养液中随机挑选3个克隆株(诱导耐药株以敏感株-TILr表示),连续无药培养3代后测定替米考星对它们的MIC,结果所有克隆株的耐药表型均稳定存在。进一步测定诱导耐药株对红霉素、泰乐菌素、吉他霉素、阿奇霉素和林可霉素5种抗菌药物的敏感性,结果见表1和表2。数据显示,鸡毒支原体的替米考星诱导株对红霉素、泰乐菌素、吉他霉素、阿奇霉素和林可霉素均呈现交叉耐药,其中对红霉素、吉他霉素和阿奇霉素的耐药水平比对泰乐菌素和林可霉素的耐药水平更高;多杀巴氏杆菌的替米考星诱导株对红霉素和阿奇霉素呈现高水平交叉耐药,对泰乐菌素呈现低水平交叉耐药,对吉他霉素的MIC提高约4倍,对林可霉素的MIC提高约8倍。4替米考星的耐药性4.1本试验测得替米考星对鸡毒支原体的MIC为0.004～0.008μg/mL,该结果与王志强等测得的0.00625μg/mL和Jordan等测得的0.0025μg/mL较一致。总体上替米考星对鸡毒支原体有较强的体外抗菌活性,MIC水平略低于或相当于泰乐菌素。本试验还测定了红霉素、泰乐菌素、吉他霉素及林可霉素对鸡毒支原体的MIC,测定结果与文献报道基本相符。在含递增浓度替米考星的液体培养基中继代培养鸡毒支原体,9代后菌株的MIC可提高万倍以上,该结果与Zanella等报道泰乐菌素(替米考星的前体药物)作用下经8～11次继代培养可诱导获得高耐药鸡毒支原体菌株的情况较一致,表明替米考星与泰乐菌素一样较易诱导鸡毒支原体耐药性。交叉耐药试验结果表明,鸡毒支原体的替米考星诱导耐药株对红霉素、泰乐菌素、吉他霉素和阿奇霉素表现交叉耐药,对林可霉素也表现交叉耐药。Ose曾发现鸡毒支原体泰乐菌素、红霉素耐药株对替米考星表现耐药;相关研究获得的鸡毒支原体林可霉素诱导耐药株对红霉素、替米考星、泰乐菌素、吉他霉素和阿奇霉素也存在低水平交叉耐药(数据未列出)。有必要获取鸡毒支原体临床耐药株,验证其对大环内酯类和林可霉素的交叉耐药情况。临床上广泛使用红霉素、泰乐菌素、吉他霉素和林可霉素等抗菌药物防治鸡慢性呼吸道病及其他呼吸道感染诱导鸡毒支原体产生的耐药性可能会影响替米考星的疗效。4.2替米考星由泰乐菌素半合成,与泰乐菌素的抗菌谱较一致,但对巴氏杆菌有比泰乐菌素更强的抗菌活性,Ose报道替米考星对多杀巴氏杆菌的MIC95为6.25μg/mL,不同血清型、不同来源菌株对其MIC无影响,近期临床分离菌株与历史保存菌株的MIC也较接近。本试验测得替米考星对不同来源多杀巴氏杆菌临床株的MIC为1μg/mL,与红霉素(1～4μg/mL)相当,不及阿奇霉素(MIC为0.125～0.5μg/mL),比泰乐菌素、吉他霉素、林可霉素的MIC低8～32倍。替米考星已成为防治畜禽呼吸道感染的重要药物,但随着替米考星的使用,多杀巴氏杆菌临床株对替米考星的敏感性逐渐降低,并且开始出现耐药株,个别地方分离菌株的耐药率甚至高达20%。因此有必要阐明替米考星应用与多杀巴氏杆菌临床株耐药性之间的因果关系。4.3本试验进行多杀巴氏杆菌对替米考星耐药性的体外诱导试验研究,结果表明多杀巴氏杆菌在替米考星作用下较易获得耐药性,并且替米考星诱导耐药株对红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素呈现高水平交叉耐药,对吉他霉素和林可霉素呈现低水平交叉耐药,这与Ose报道多杀巴氏杆菌的泰乐菌素、红霉素耐药株对替米考星交叉耐药相符,说明替米考星与其他大环内酯类抗生素和林可霉素之间存在相同的耐药机制。日本于1994年和1996年分别批准替米考星用于猪和牛的呼吸道疾病治疗,但Yoshimura等发现1994-1998年从猪体分离的多杀巴氏杆菌菌株对替米考星的敏感性较低,甚至从牛体分离获得了对替米考星高耐药的3株多杀巴氏杆菌,Watts等也从使用替米考星之前的美国牛体分离到对替米考星高耐药的多杀巴氏杆菌。这可能与长时间将替米考星前体物泰乐菌素作为抗菌生长促进剂使用有关。4.4本试验测得替米考星对猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC为0.5～1.0μg/mL,与Yoshimura和李胜宏等测得的结果较一致。替米考星对放线杆菌性猪胸膜肺炎有良好的治疗效果,体外试验结果提示不易诱导猪胸膜肺炎放线杆菌产生耐药性,说