大鼠腹膜伤害性刺激cfos在中枢神经系统的表达及分布

大鼠腹膜伤害性刺激cfos在中枢神经系统的表达及分布

创伤引起的疼痛是神经系统的一个重要机制。然而，到目前为止，中枢神经系统的疼痛和疼痛生成机制尚不清楚，这使得理解疼痛机制变得困难。伤害性刺激引起腹痛是常见的临床症状,但哪些中枢结构与伤害性刺激引起的腹痛有关,目前还不十分清楚。本研究将1%的乙酸注入大鼠腹膜腔,造成经典腹腔痛觉刺激模型,观察中枢神经系统的c-fos阳性神经元出现的时间和分布规律,进而研究中枢神经系统内与伤害性刺激引起腹腔痛觉的相关结构。1材料和方法1.1饲养环境分组选用健康Wistar大鼠56只,雌雄不限(新疆医科大学实验动物中心提供),体重250～300g。置于安静、温暖(20℃)、避强光的环境中饲养48h。随机分为实验组(n=48)和对照组(A组,n=8)。实验组:动物注射乙酸后分别存活30min(n=8)、1h(n=8)、2h(n=8)、4h(n=8)、6h(n=8)、8h(n=8),将其依次分为B组、C组、D组、E组、F组、G组。1.2大鼠的起效试验(1)实验组:将大鼠放置于透明的有机玻璃盒内,滴入少许乙醚,麻醉起效后,将大鼠立即取出,并向腹膜腔注射1%乙酸2ml。(2)对照组:将大鼠在术前环境内喂养48h,不给予腹腔刺激,常规麻醉灌注处死。1.3聚甲醛液的灌装将大鼠开胸,经心脏灌注0.9%氯化钠注射液150ml以冲净血液,采用4%多聚甲醛液先快灌200ml,然后再慢灌200ml,即可固定。速取全脑与脊髓,放入10%福尔马林液固定待用。于T6～L3脊髓后角、延髓孤束核、臂旁核、蓝斑核、中缝背核、下丘脑、室旁核、视上核、杏仁核所在部位做冠状切片(片厚4μm)。1.4dab/苏苏染片染色(1)常规HE染色核细胞团,功能区定位选片。(2)抗c-fos免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物公司,切片染色步骤按此盒说明进行,DAB显色,苏木素复染,封片,观察。以细胞核染成棕黄色为c-fos阳性细胞,c-fos阳性神经元的数量以每单位视野(200μm2)内c-fos阳性神经元数目来表示。1.5统计处理采用SPLM软件对数据进行统计学分析,所得数据均用x¯±sx¯±s表示,组间比较采用t检验,检验水准α=0.05。2结果2.1对照组c-fos免疫染色结果T6～L3脊髓后角、臂旁核、室旁核可检出少量c-fos阳性神经元。2.2各组中缝背核c-fos表达情况比较动物被灌注固定后腹腔解剖,肉眼可见腹膜充血水肿,大网膜渗出增加,有腹膜炎的病理特征。B、C、D、E、F组与A组比较c-fos表达差异有统计学意义(P<0.05),B组与C、D、E组比较差异也具有统计学意义(P<0.05),D组与E组比较c-fos表达差异无统计学意义(P>0.05),D、E组与G组比较c-fos表达差异有统计学意义(P<0.05),A组与G组比较c-fos表达差异无统计学意义(P>0.05),结果见表1。结合图1可知,c-fos表达通常于灌注30min开始,2h到达高峰,于4h后开始下降,8h接近正常水平,在灌注2～4h后脊髓T6～L3后角、孤束核、臂旁核与蓝斑核、中缝背核c-fos表达最为强烈,中缝背核与前述核团比较c-fos表达弱且持续的时间较短;下丘脑、视上核、室旁核、杏仁核c-fos表达也较明显。3c-fos阳性神经元/伤害性刺激c-fos癌基因存在于包括神经元在内的绝大多数细胞中,当机体受到疼痛刺激后,在其痛觉传导路中的所有神经元即会作出反应,并且激活神经元内的c-fos癌基因。c-fos癌基因转录并翻译为Fos蛋白。Fos蛋白实质是一种细胞核的磷酸蛋白,它在胞浆内合成,然后进入胞核,与DNA结合后调节其它基因的转录,机体从受到刺激到翻译出Fos蛋白,约需30min时间。给予动物痛觉刺激后,用免疫组织化学方法可检测Fos蛋白在中枢神经系统内的表达及分布状态,从而可显示中枢神经系统内与伤害性刺激引起腹痛的有关核团。本研究结果表明,实验组与对照组Fos蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05),脊髓T6～L3后角、孤束核、臂旁核与蓝斑核、中缝背核、下丘脑、视上核、室旁核、杏仁核c-fos表达常于灌注30min开始,2h到达高峰,于4h后开始下降,8h接近正常水平,从而可推知这些核团与伤害性刺激引起的腹腔痛觉相关。将大鼠腹腔注入乙酸后,发生化学性炎症,造成腹膜炎的病理模型。乙酸注入腹膜腔后所诱发疼痛的来源有两种,即躯体痛和内脏痛。壁腹膜受到的刺激所产生的冲动是由脊神经传导的,属于躯体感觉。腹腔脏器的痛觉由迷走神经及交感神经传入,属于内脏感觉。因此,中枢c-fos阳性神经元就有两条被激活的途径,即躯体痛传入和内脏痛传入。本研究采用经典腹腔痛觉刺激模型具有方便、经济等优点,但该模型不能明确区分躯体痛传入和内脏痛传入,有待今后进一步改进。本实验结果表明,在灌注2～4hT6～L3脊髓后角、孤束核、臂旁核与蓝斑核、中缝背核c-fos表达最为强烈,这与王强武等的实验结果有相似之处,并且下丘脑、视上核、室旁核、杏仁核c-fos表达也较明显。这些核团有的是内脏感觉的初级传入直接终止的部位,有的与痛觉传导有关,有的参与镇痛,有的参与情绪反应,而且这些核团之间都有纤维联系。Kalia等采用辣根过氧化物酶(HRP)法证明腹腔脏器的初级传入经迷走神经终止孤束核,而躯体的疼痛刺激可经脊神经到脊髓后角,再由脊髓后角到孤束核及臂旁核,一般认为臂旁核是感觉中继核。Hylden等研究证实脊髓到臂旁核通路主要参与传递特异性伤害信息。因此,孤束核、臂旁核都是直接或间接的接受伤害刺激引起痛觉的信息核团,有较强的c-fos表达,且持续时间较长,党小荣等的实验结果证实了此观点。据Astonjones等报道,蓝斑与脑内多种结构有广泛的联系,并与多种感觉调节有关。蓝斑内有较多的c-fos阳性神经元,说明蓝斑可能与腹膜伤害性刺激所引起腹腔痛觉有关。中缝背核的c-fos表达较弱一些,且持续的时间较短,提示中缝背核接受孤束核的投射,也参与镇痛。下丘脑、室旁核、视上核、杏仁核有较明显的c-fos表达,这可能是孤束核上行投射激活的作用结果。由此可见,下丘脑、室旁核、视上核、杏仁核在伤害性刺激引起腹腔痛觉信息传递中起中继作用,即跨神经元的作用